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SDS-PAGEのゲルのアクリルアミド濃度の上限は？ トピック削除
No.937-TOPIC - 2008/04/09 (水) 07:22:40 - vd
あるタンパク質をタグ抗体を用いてウエスタンで解析したいのですが、検出したいタンパク質はだいぶ小さいのでできるだけ固いゲルで泳動したいと思います。

SDS-PAGEのゲルのアクリルアミド濃度の上限はどのくらいなのでしょうか？

某B社のprecast gelをみたところ18%というのがあったので、このくらいまでならいけるのかな、とも思うのですが。。。

このくらいまでなら大丈夫、というのを教えていただけないでしょうか？よろしくおねがいします。
　
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No.937-8 - 2008/04/10 (木) 08:17:52 - おお
PVDFはたいていのウエスタンではポアサイズ0.4umぐらいのものを使うのが普通ですが、0.2umの物がいいかと思います(わたしは普通のウエスタンでも0.2umの物を使ってますが)。メタノール20%、SDS抜きはいい選択だと思います。転写は普通のタンパクより早いと思いますので、その辺をコントロールしないといけないかもしれませんね。例えばPVDFを2枚かさねて転写して、ゲルから遠い方にタンパクが移動してないかとかモニターしながらのほうが条件が見つけやすいかもしれません。

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No.937-7 - 2008/04/10 (木) 06:46:03 - vd
質問者です。

みなさん、ありがとうございます。

とりあえず18%か20%のゲルか、トリシンSDS-PAGEを試してみようと思います。手元にある試薬でできるので。

ところでもう一つ質問したいのですが、SDS-PAGEの後はPVDFメンブレンにトランスファーしてウエスタン解析をしたいと思うのですが、トランスファーで何か工夫がいるでしょうか？

私が今回検出したいタンパクは5kDa程度（FLAGタグつき）で、pIは11程度です。これまで20-90kDaのタンパクをウエスタンで検出して来ましたが、TrisとGlycine入りで、Methanolは20%、SDS無しのバッファーで問題なく検出できていました。このバッファーでいけそうでしょうか？それとも小さいタンパク用のトランスファーバッファーなどあるのでしょうか？

よろしくお願いします。

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No.937-6 - 2008/04/09 (水) 11:36:35 - おお
皆様の意見とほぼ同様です。20%ぐらいでまでだと思います。私は18%までは実際に作って流したことがあります。加えてT/Cをいじってみるのもてかもしれません。ゲル重合の温度の問題はAPSを下げたりすればコントロールできると思います。最近のプロトコールはオリジナルに比べてかなり過剰量使うように書いているのが結構あるようですが、多分脱気をしないで作るのが前提のプロトコールになってきてるのかもしれません。
ゲルだけでなく、バッファー系も低分子にあったものが開発されていますので、そういうのも考慮に入れると言い家と思います。例えばTRICINEを使ったSDSPAGEだと、12%ぐらいのゲルでも5kDaは楽勝だったと思います(きっちり覚えてませんが、、、)

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No.937-5 - 2008/04/09 (水) 10:21:42 - pdpdpd
分子量はいくつなのでしょうか？

20%位は作れますし、gradient gelでもよければバイオラッドなどで買えます。
ゲルを作る溶液を、脱気し、氷で冷やしてからTEMEDを入れて重合させた方が、ゆっくり固まってうまくできます。

1.5kなどの小さいマーカーもバイオラッドが売ってますから、1%か2%刻みで何枚かゲルを作って、マーカーを流してみたらいいと思います。

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No.937-4 - 2008/04/09 (水) 08:40:49 - う〜んと
15%を超えるとゲルが固まるときに出す重合熱で、ゲルの温度が上がって泡ができやすいです。きれいなゲルを作るには工夫と試行錯誤が必要かも。

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No.937-3 - 2008/04/09 (水) 08:23:40 - あべちゃん
NuPAGE with MES bufferってのもあります。
5.2kDaの蛋白質をこれで発現量など観ています。
メーカーのホームページによれば、3.5kDaでも分離できそうな図が書いてあります。ただ、僕自身は3.5kDaの分離能について確認した事はありません。

トリシンゲルでは？ 削除/引用
No.937-2 - 2008/04/09 (水) 08:10:36 - K
確かにアクリルアミドの％をあげるのもひとつですが、トリシンゲルを試してみるのは
いかがでしょうか。過去ログを引いてみると文献の紹介もあったと記憶しています。
私自身は20％までゲル濃度をあげてみたことがあります。

SDS-PAGEのゲルのアクリルアミド濃度の上限は？ 削除/引用
No.937-1 - 2008/04/09 (水) 07:22:40 - vd
あるタンパク質をタグ抗体を用いてウエスタンで解析したいのですが、検出したいタンパク質はだいぶ小さいのでできるだけ固いゲルで泳動したいと思います。

SDS-PAGEのゲルのアクリルアミド濃度の上限はどのくらいなのでしょうか？

某B社のprecast gelをみたところ18%というのがあったので、このくらいまでならいけるのかな、とも思うのですが。。。

このくらいまでなら大丈夫、というのを教えていただけないでしょうか？よろしくおねがいします。
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