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(無題) 削除/引用 No.931-4 - 2008/04/08 (火) 19:13:52 - ノーザン初心者 ありがとうございました。アドバイスをもとに設計してみます。

(無題) 削除/引用 No.931-3 - 2008/04/08 (火) 19:13:15 - Rocheのまわしものではないです へー、最近はプローブまで外注で作ってくれるのですか。 oligo DNA合成で標識を入れるというのとは違うのですよね。 oligo合成では通常末端標識ですが、もし内部標識をしてくれるサービスがあるとしたら、 ＞短すぎてラベルされないいとかいう ことはないと思います。 短すぎてラベルされないと言うのは、random primerで酵素的に合成する場合のことでしょう（つまり、鋳型DNA対して6-8 ntくらいのランダム配列のプライマーを投入して、そこからDNA合成させるときに標識ヌクレオチドを取り込ませる方法。おおよそ300塩基に一箇所くらいの割合でプライマーが付くくらいのデザインが普通なので短すぎる鋳型には不向き）。 PCRやin vitro transcriptionで内部標識する分には、鋳型の長さに関係なく、一定の頻度で標識ヌクレオチドが取り込まれます。 感度では、1分子のDNAに対して基本的に1標識しか入らない末端ラベルより、一定頻度で標識ヌクレオチドが入る内部標識の方がすぐれています。 末端標識でNorthernをやるとしたら、よほどコピー数の多いターゲットでなければ難しいでしょう。それでもターゲットがある程度の長さのあるものなら、ハイブリする場所の違う複数の配列の末端標識オリゴを混合して感度をかせぐ使う方法もありますが、ご質問の場合は難しいですね。 オリゴの末端にterminal tranferaseで標識ヌクレオチドのtailを付ける方法だと感度を上げることができるかもしれません。 いずれにしても、プローブが短い、ターゲットも短いとなると、、ハイブリ、洗いの条件がクリティカルですよ。ラベルが入りすぎてもハイブリッドの安定性が下がる可能性もありますし。 DIGは悪くないですよ。文献等でみられる実験例も飛び抜けて多いです。 ビオチンの方が歴史ははるかに古いですが、新参者のDIGに取って代わられた感があるくらいです。

(無題) 削除/引用 No.931-2 - 2008/04/08 (火) 16:46:42 - おお 求めている感度に大きく作用されますので、完全なお答えはできません。ラベルはそんなに感度が必要でなければ末端でもいいと思いますが、ある程度以上の感度が必要な時は勧めません、数十ベースと言う事ですが50ー60ベースなら何とかなりそうな長さですが、感度的にもう少し何とかしたいというのであればその配列を5ー10回ぐらい繰り返した長いDNAをテンプレートに使うと感度がかせげます。

ノーザンの詳しい人教えて下さい。 削除/引用 No.931-1 - 2008/04/08 (火) 15:41:54 - ノーザン初心者 ノーザンブロッティングのDNA プローブを外注で作ろうと思っています。ラベルの仕方がいろいろあってどれがいいのか分かりません。DIGはよくないとネットとかでよく見るのでこれは止めようと思います。それでビオチンにしようかと考えましたが、どんなもんでしょうか。末端をラベルするのとインターナルでラベルするのとがありますが、やっぱり感度あげるならば後者の方がいいのでしょうか。あとこれとは別に、目的遺伝子が小さいのでハイブリダイズする部分の配列だけではプローブは数十bpの長さです。このくらいだと短すぎてラベルされないいとかいう話を見た事があり、それでもっと長くした方がいいかとも思うのですが、こういう時はただ関係ない配列を付けて長くすれば良いのでしょうか。以上、経験のある方いましたら教えて下さい。よろしくお願いいたします。

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