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有難うございます。 削除/引用 No.930-6 - 2008/04/10 (木) 12:06:23 - ねこ ご助言有難うございます。 いくつかの方法(ジリンジやDNase)を試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.930-5 - 2008/04/09 (水) 01:11:46 - おお SDSで解析する前に精製と書いてますので、なにかカラムとか使っているんでしょうか? 粘性はDNAによるもので、対処方法は幾らかあります。目的などにもよりますのでよさそうなものを選ぶといいかと思います。 まずは細胞をライシスした時に物理的にDNAを切断する方法です。超音波処理か23ー25Gの注射針をシリンジを使って何回か通すと、粘性がなくなっていきます。超音波は可也強い出力を持ったものが必要で、物によっては弱すぎるものもあります。非変性条件下では代わりにDNAaseを使えます。 もう一つはDNAが溶出してこないような条件を使う方法です。塩濃度200mM以下でTRITON X-100やNP40、1%ぐらいまでの溶液が細胞をライシスする時によく用いられます。この条件ではクロマチンはその構造を維持しているためDNAは溶解してきません。細胞溶解後、遠心すると核マトリクス、クロマチンなどを主成分のペレットが得られますので、上清を実験に使うわけです。

(無題) 削除/引用 No.930-4 - 2008/04/08 (火) 19:12:01 - 名無し ネマネバしてるのはDNA です。そのまま電気泳動しても上手くいきません。ソニケーションすればなくなります。私は、細胞をPBSで洗って、SDS-sample buffer で溶かして（蛋白質濃度薄めすぎないように液量に注意）、よくソニケーションしてDNAを切って（＝粘性がなくなればOK）、15C前後で12000xgで５分くらい遠心して（普通は沈殿はほとんどない）上清とって、一部はとって適当に薄めて蛋白質濃度をBCAで測って、最後にbMEとBPB入れて加熱してSDS-gelにアプライしてます。問題なくいけてます。

通りすがりさん有難うございます。 削除/引用 No.930-3 - 2008/04/08 (火) 16:05:33 - ねこ ゲノムDNAでしたか。 > 細胞を直接 SDSの入ったbufferなどで溶解したりしてませんか? 直接というのはどのような状況でしょうか。 私がやった方法としてはまず細胞をPBSで洗いった後、SDSまたはUreaの入ったbufferで溶解させました。

(無題) 削除/引用 No.930-2 - 2008/04/08 (火) 15:37:58 - 通りすがり それはおそらく普通の培養細胞でのことなら、ゲノムDNAです。 細胞を直接 SDSの入ったbufferなどで溶解したりしてませんか? 解決するには、目的の抗原分子がもっとmildな条件でも可溶化できるなら TX100やRIPA bufferなどで可溶化させる。 あるいはlysateを注射器の針で数回strokeするか 超音波にかけるとDNAは断片化でき、粘性は少なくなります。

細胞の溶解について 削除/引用 No.930-1 - 2008/04/08 (火) 15:04:01 - ねこ 細胞を精製・SDS-PAGEで泳動するために、溶解したところ粘性が高くピペットですうのも困難なくらいです。このまま精製したところタンパク質量が極端に減ってしまいました。 ・この粘性は細胞中のタンパク質量と関係しているのか？ ・精製する際には粘性がなくなるくらいに溶解バッファーの量を増やしたほ　うがいいのか？ 経験が浅いもので、原因がわからずにどうしたらいいのか困っています。 どなたかよろしくお願いいたします。

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