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結果 削除/引用 No.929-8 - 2008/04/21 (月) 18:38:46 - ジャックニコルソン 皆さんのご意見感謝致します。 あれから試しにIP後の未変性溶出を試みました。 結果として、IP後のレジンにDTTを10, 50, 250 mM含有バッファーを加えた後、 ４℃で１時間インキュベートして、遠心し、SupをSDS-PAGE／ ウエスタンで検出してみたところ、 どの条件でもほとんど溶出されていませんでした。 また、デオキシコール酸0.5% w／vで溶出したところ少しだけ溶出されてくるという結果でした。 まとめると、小生のお試し実験ではあまり効率よく溶出されなかったという事です。 まあ、Alternativeとして最後のご意見にあったように、 GDG後にIPするということも検討していますが、、。 あと、参考になるページのURLを下に示しておきます。 http://www.technochemical.com/faq/reductant.htm

(無題) 削除/引用 No.929-7 - 2008/04/08 (火) 18:43:50 - IP ジャックニコルさんの目的だと、言われておられる方法とは逆に、 lysateをまず、そのままグリセロール勾配で分けて、 それから各分画を免疫沈降すればいいように思います。 グリセロールのために沈降しにくいようでしたら、 バッファーで2倍程度に希釈してグリセロールを10％以下程度にして、 担体の沈降を見ながらやればOKです。 酸・アルカリ処理は、S-Sを持った細胞外蛋白には使える場合もありますが、 S-Sを持たない細胞質蛋白では、変性が強く起きるので使えないことが多いかな。 そもそも複合体解析が目的ならば変性される可能性があるのでpH処理は使えないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.929-5 - 2008/04/08 (火) 16:45:22 - L 目的の複合体が複合体を維持するために、正しいジスルフィドのかかり方が必要、 ということはないでしょうか？ もしそうであるならば、DTTは使えない可能性が高いです。 おおさんがおっしゃるように、やはり、酸で落とすのがよろしいかと思います。 受ける容器(1.5 ml チューブなど)に濃いTris(pH 8-9)を少量入れておいて、 (もちろん、どんな比率で中性になるかどうかの予備試験は必要ですが) 溶出物が即中和されるようにしておけば、変性も防がれるでしょう。 ただ、Trisが生化学反応を阻害したり、ほ乳細胞に毒性を示す、 という記述もありますので、Phosphate系などへの置換(透析orゲルろ過)が必要かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.929-4 - 2008/04/08 (火) 16:32:33 - おお 酸性かアルカリに振るのがまず最初に浮かびまず。大抵の抗体は、抗原を使ったアフィニティーで精製する時、溶出条件として使います。グリシンHClなどでpH2から3ぐらいに持っていくのですが(アルカリだと11ぐらでしょうか、pHを合わせていないTRISとかたまに使われます)、非常に酸に強いものは1ぐらいまで持っていかないと外れないともいわれています。お使いの抗体がすでにアフィニティー精製されているのであれば、この手は使いやすいと思います。マイルドなデタージェントであっても、抗体との相性で外れるものもありますが、これは相性なので一つ一つチェックしていく必要があります。CHAPSやデオキシコール酸などは抗体によっては結合力がなくなってしまいます。ただし、コンプレックスも部分的に外れてしまうことがあります。たとえばサイクリン-CDK-サイクリンインヒビターのコンプレックスはデオキシコール酸でサイクリンインヒビターだけが遊離しサイクリン-CDKは安定であったりします。 抗原抗体を離すのに次によく使われるのは、マイルドなカオトロピック試薬です。抗体精製や、抗体によるアフィニティーの抗原遊離、再生でLiClやMg++などがたまに使われます。Mg++は抗体では好んで使う人もいますが、その他の生化学てきな解析に用いている人は少ないので、タンパクのコンプレックスについては私自身あまりどうなるのか感覚的に分かりません。LiClは疎水性相互作用を弱めたりという点でよく使われます。LiClは1-2Mぐらいまで上げれば外れると思いますがこれも抗体によりますのでなんともいえません。Liでなくても、塩濃度でコントロールできる場合もあると思います。1MぐらいのKClかNaClでしょうか。もちろんこれも抗体次第です。 DTTは意外と抗体が抵抗性を持っていますので上記とのコンビネーションで使うと何とかなるかもしれません。ただしDTTは酸性ではその効果を発揮しません。それと10mMとか言うのではなく100mMとか500mMぐらい加えた方がこの場合はいいかもしれませんね。10mMで、加熱しないと外れないと仰る方もいます。もう少し強い還元剤と言うのもいいかもしれませんが、私は具体的にそのような試薬を知りませんので理屈はよくても、アドバイス出来ないのが現状です。

(無題) 削除/引用 No.929-3 - 2008/04/08 (火) 15:44:02 - ジャックニコルソン レスありがとうございます。 酸性pHにすると抗原抗体の相互作用は外れやすくなるのは初耳でした。 もしかしたらやってみるかもしれません。 最後のアドバイスにありました「HisタグでImidazole溶出」は一度考えたのですが、 （詳細は割愛しますが、）GST／グルタチオンを含めて実験の制約上不可能であり、 どうしても免沈という手段を選ばなくてはいけません、、。 補足で説明させて頂きますと、小生の最初の質問にあった「DTTなどの還元剤を加える」というのは 免沈に用いた抗体（IgG)のジスルフィド結合の切断を意図しております。 それにより抗体が失活して、ProteinA-抗体の結合はもちろんの事、 抗体ー目的タンパクでの結合も外れると想像（というか期待）しています。 もしこの正誤についてご経験があるならご意見をうかがおうとした次第ですが、 小生の方でもくよくよ悩まずに近日中に一度トライしてみます。 （もちろん皆様からのご意見は引き続き希望します） 結果は後ほどお知らせしようと思います。 何卒よろしくです。

(無題) 削除/引用 No.929-2 - 2008/04/08 (火) 14:42:47 - pdpdpd 酸性pHにすると抗原抗体の相互作用は外れやすくなります。 タンパク質複合体の相互作用は破壊せず、抗体ー抗原相互作用だけを壊す、ということですから難しいはずですし、抗体が結合したままProteinAから外れた複合体が残って解析しにくい気がします。 HisタグでImidazole溶出はできないのでしょうか。

免疫沈降後の非変性条件下での溶出法 削除/引用 No.929-1 - 2008/04/07 (月) 20:39:04 - ジャックニコルソン みなさん。免疫沈降後の溶出法について質問があります。 免疫沈降した後に沈降物（多タンパク複合体）をグリセロール密度勾配遠心で解析しようと計画しています。そのため非変成条件下で溶出しなければなりません（変成してしまうと、目的の複合体もバラバラになってしまいますので、、）。たとえば、抗Flag抗体で免疫沈降をした場合にはFlagペプチドで競合溶出させることができますが、小生の場合はそのような都合の良いペプチドがありません。そこで、考えたのですが、免疫沈降したものにDTTなどの還元剤を加えることで目的の沈降物をEluteする事は可能でしょうか？ みなさまのご意見を伺えれば幸いです。 何卒よろしくです。

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