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NIH-3T3の培養について トピック削除
No.927-TOPIC - 2008/04/07 (月) 17:00:20 - hatti
最近、NIH-3T3細胞の培養を始めたものです。
コンフルエントにならないように気をつけながら培養していますが、
培地交換時に細胞が剥がれてしまい、困っています。
もともと、NIH-3T3が物理刺激に弱い細胞なのか、
または、形質変化してしまったのかが知りたく、投稿させていただきました。

よろしく、ご教授ください。
 
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(無題) 削除/引用
No.927-18 - 2008/04/30 (水) 19:28:15 - MP

> spontaneous transformation を防ぐためFBSではなくCSを使用するのが一般的。
>
> とのことですが、CSを使うとtransformationが防げるのはなぜなのでしょうか?

今日出たPNASにその答えを含むと思われるReviewがありました。

http://www.pnas.org/cgi/content/abstract/105/17/6215?etoc

半分くらいしか読んでないのですが、どうやらCSよりFBSで培養する方がNIH3T3のgrowthが悪くなり、その選択圧によりspontaneous transformationを起こしやすいpopulationが増えてくるらしいです。

(無題) 削除/引用
No.927-17 - 2008/04/24 (木) 12:51:24 - -
使われているNIH3T3が剥がれやすい性質に変わってしまっている可能性はないのでしょうか?
別のNIH3T3をどこかから得られるのもオプションの一つかと。

昔のことなので 削除/引用
No.927-16 - 2008/04/24 (木) 12:15:53 - mom-a
お役にたつかどうかわかりませんが…

培養用dish
IWAKIのtissue culture dish (コラーゲン等のコーティングなし)
培地
GibcoのD-MEM powderを溶かし、CO2を吹きこんでpHを調整して濾過滅菌後、10%FBS添加( 一応Lotチェックはしましたが、それほどLotによる違いはなし)
抗生物質は加えていませんでした。影響があると思って加えなかったわけではなく、加えないのがボスの好みだったので。
継代
3〜4日に1回継代(1/8〜1/32 ←増殖が良かったので、かなり薄めたこともあります)。
PBS(-)で1度洗浄、トリプシン-EDTAを適量加え、室温放置(比較的すぐ剥がれる)し、培地(トリプシン-EDTAの10倍量以上)を加え、遠沈管に移す。 800rpm(スイングローター), 5min, 4度で遠心。ペレットを培地で懸濁し、一部をとって培地を入れておいたプレートに添加。
培地交換
週2で継代している間は培地交換してませんでした。
実験中培地交換したこともあったと思いますが、特別に気を使ったことはなかったです。

ところで、私が今使っている細胞で剥がれやすいといえばHEK293で、それこそ冷たい培地を入れれば見る間に剥がれてきます。培地交換時は37度に温めた培地をゆっくり加えるようにしていますが、多少は剥がれているのかもしれません。
通常の継代時は、あまり注意して観察していませんでした。
トランスフェクションなど行う時はコラーゲンコートdishを使っていて、実験に支障がない程度には接着しています。

(無題) 削除/引用
No.927-15 - 2008/04/21 (月) 17:57:22 - hatti
返信がおくれまして、申し訳ありません。

培地交換時は、剥がれるのが怖いためwashせずに交換しています。
使用時は、培地を37度に温めてから使用しています。

培地に関しては、PHが問題かもしれないと考え、
赤紫になった培地に関しては、HEPESで調製して添加してみましたが、
状況は変わりませんでした。
グルタミンに関しては,培地交換時には剥がれますが、
継代後は普通に接着していますし、
調製したばかりの新しい培地を添加しても剥がれるので、
グルタミンによる影響は少ないのではないかとも考えています。
Half Medium Changeも試みてみましたが、
だめでした。

培地に問題があるとすれば、
他メーカーのDMEMも検討してみようと思います。
他には、PS(ペニシリン・ストレプトマイシン)が
何か影響を及ぼすということは考えられますか?

Dishは某有名メーカーのフラスコを使用しており、他の接着細胞では
上手く培養できておりますので、dishの問題ではないと思います。

血清のロットに関しては、最近変えたばかりですが、
替える前も剥がれていました。
ロットチェック時も、培地交換をするとどうしても細胞が剥がれるので、
最初から細胞をそれぞれロットチェック用の培地に懸濁して
撒き込んだ次第です。

手技の確認のためにも、一度ラボの他の人に、培地交換をお願いしてみます。

また、問題なくNIH3T3細胞を培養できている方の、
詳しい培養プロトコール
(継代方法、培地交換方法、播き込み数、使用培地等)
を教えていただけないでしょうか?

以上長々と申し訳ありませんが、
宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用
No.927-14 - 2008/04/15 (火) 15:33:38 - りょう
dishはマトモな物を使用されているのでしょうか?
他の接着細胞は上手く培養できているのでしょうか?
同じラボの他の人が培養しても同じようになるのか?
この辺を検討すればマテリアル・腕の問題か?細胞が劣化したのか?の判断はつくはずです。

(無題) 削除/引用
No.927-13 - 2008/04/15 (火) 13:13:36 - おお

> よく観察してみると、培地交換時は剥がれていないのですが、
> 培地交換の後、約1分後から細胞の軸足?というか先端の細い所が縮み、
> 一部の細胞は次第に細胞が丸くなり光り、剥がれます。
> 接着している残りの細胞は、コロニー状になっているという形です。
>
多分バイチに問題があるのだと思います。例えば、バイチのフェノールレッドがすでに赤く(紫がかった)なってませんか?温度が低すぎませんか?古すぎませんか?ふるすぎるとバイチのグルタミン酸/グルタミンが分解してアンモニアが増えてきます。最近そういった問題を解決するためにグルタミン酸/グルタミンの代替として、GLUTAMAXが使われるケースがあります。
また、血清のロットによるものかもしれません。可能なら、血清ロットのサンプルなど取り寄せて、比較してみるのも必要かもしれません。

(無題) 削除/引用
No.927-12 - 2008/04/14 (月) 15:36:34 - ~
DMEM+10%FBSで培養していた際には、HeLaやSaos2に比べれば剥がれやすかったですが、
培地交換後に丸くなるということはありませんでした。

継代時ではなく、培地交換時に剥がれてきているのですよね?
そうであれば、継代時ではなく、培地交換のプロトコル(か細胞)に問題があることになります。
継代の話と培地交換の話が混ざっていますね。

培地交換時の注意点で思いつくのは、培地はあらかじめ37℃に暖めずに、4℃のままかけたりしていませんか?
4℃のまま細胞にかけると、細胞によっては、増えが悪くなったりします。
(NIH/3T3ではどうなるか試したことがありませんが)

また、培地交換時に、EDTA入りのPBSで洗ったりしていませんか?
NIH/3T3は、トリプシン後に遠心しないで1/10で撒くと貼りつかないくらい、EDTAに弱かったと記憶しています。

培地交換時に液の勢いで剥がれることはあるでしょうけれども、
培地交換の1分後に剥がれだすのであれば、培地に問題がある気がします。

(無題) 削除/引用
No.927-11 - 2008/04/14 (月) 14:42:07 - hatti
様々なご返信ありがとうございます。
washをPBSに変えたり、トリプシン濃度を0.05%に落としましたが、
やはり細胞が剥がれます。
かなり自分の手技も疑いましたが、
試行錯誤の上どうしても剥がれてしまうので、投稿した次第です。

よく観察してみると、培地交換時は剥がれていないのですが、
培地交換の後、約1分後から細胞の軸足?というか先端の細い所が縮み、
一部の細胞は次第に細胞が丸くなり光り、剥がれます。
接着している残りの細胞は、コロニー状になっているという形です。

やはり、これは、NIH3T3の性質的な問題ではないのでしょうか?
新たな細胞を購入すれば、解決する問題なのでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.927-10 - 2008/04/10 (木) 22:21:31 - ひまわり
NIH3T3を96-well plateを使ってmedium changeやwash outをすると細胞が脱落してしまう人がいますが、これは細胞操作の基本的な手技が未熟な人が多いですね。
NIH3T3は接着は弱くもなく強くもありません。
HUVECと同じくらいだと思います。

また、PBS-EDTAを加えると細胞が球状に形態変化して接着が弱くなりますので、おそらくそれも原因の一つであると考えられます。
EDTAを抜くのが肝要だと思います。

細胞を確実に回収したいのであれば、遠心管を先の細いものにして、遠心時間を10分にするのも手です。

FCSはFBSよりも増殖因子の量が少ないのは仰られる通りですが、なにより安価であるということからよく利用されます。(私は使いませんが)
NIH3T3はFBSを使っても特に問題ありませんよ。

(無題) 削除/引用
No.927-9 - 2008/04/09 (水) 01:41:08 - おお
0.25%トリプシン-EDTAは濃度が高いかもしれませんね。それが原因で悪くなるかはなんともいえませんが、過剰のトリプシンしょりは細胞にストレスを与えるのは事実ですから。0.05%トリプシンも培養ではよく使われます。処理前のPBDーEDTAによる洗じょうは、はがれやすくて困るのであればEDTAが入っていない物を使うといいかと思います。3T3はトリプシン処理はほとんど必要のない剥がれやすい細胞だと記憶しております。

(無題) 削除/引用
No.927-8 - 2008/04/08 (火) 18:41:28 - MP
>[Re:7] hattiさんは書きました :
> 〜80%コンフで0.02%EDTA/PBSでwash

ここにEDTAが入っているのが剥がれやすい原因では?
PBSだけで問題ないはずです。

>[Re:6] pdpdpdさんは書きました :
> spontaneous transformation を防ぐためFBSではなくCSを使用するのが一般的。
> とのことですが、CSを使うとtransformationが防げるのはなぜなのでしょうか?

一般的などと書いてしまいましたが、実際に自分でくらべたわけではないですし、ちょっと言い過ぎたかもしれません。以前、細胞培養のスペシャリストの方からそう教わりました。
おそらく増殖因子の量がFCSの方が多いからということではないでしょうか?

継代方法 削除/引用
No.927-7 - 2008/04/08 (火) 18:25:55 - hatti
ご意見ありがとうございます。

まず、contact inhibitionのことですが、
きちんとかかっており、コンフルエント後5日間培地交換なしでも
培地が黄色くなること無く、接着しています。
(実験系としては、時計遺伝子の誘導を試みています)

CSを使用するというのは、過剰な増殖をさせず、
形質転換を防ぐということでしょうか。

形態については、紡錘形の細胞もありますが、
頻度としては、ATCCのHPの写真と同程度でした。

passageの方法にも問題があるかもしれませんので
以下に現在行っている方法をのせさせていただきます。

〜80%コンフで0.02%EDTA/PBSでwash
0.25%トリプシン-EDTAで室温で1〜2分静置
剥がれたら10%FBS/DMEMで回収し、
1000rpm 3分遠心
培地に懸濁し、T75フラスコに2.5x10^5cells撒き込む

この方法で問題があれば、ご指摘お願い致します。

(無題) 削除/引用
No.927-6 - 2008/04/08 (火) 14:33:14 - pdpdpd
横からすみません。

spontaneous transformation を防ぐためFBSではなくCSを使用するのが一般的。

とのことですが、CSを使うとtransformationが防げるのはなぜなのでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.927-5 - 2008/04/08 (火) 13:13:43 - おお
3T3ははがれやすい細胞ではあります。トリプシン処理のときにPBS(ー)で洗う時に剥がれたりと言う事はある様です。もし、がん遺伝子などによる形質転換を見たいのであれば、コンタクトインヒビッションがかかるかは重要ですのでチェックした方がいいかもしれません。低めの血清でコンタクトインヒビッションがかからず、マルチレイヤーで増えてくるもの(フォーカス)が無いことを確認するのがいいかと思います。血清はFCSを私は使っていました。5%ぐらいでもいいかと思います。
もしお使いの細胞がフラットでなく、丸かったり、厚みをおびて光かったり(phase contrastで)、ニューロンのできそこないみたいな細胞が多いようでしたらトランスフォーメーションを起こしている可能性がありますので要注意です。そういう細胞はさらにはがれやすくなっていることがあります。一度3T3とtransformationで文献をいくらか集めて形態を見てみるのもいいかもしれません。大抵の文献はtransformation前後の形態を載せていると思います(10から30年ぐらい前の文献が多いかと思いますが、、、)。

(無題) 削除/引用
No.927-4 - 2008/04/08 (火) 11:28:06 - MP
NIH3T3の培養はspontaneous transformation を防ぐためFBSではなくCSを使用するのが一般的だと思います。形態はやや細いとのことですが、紡錘形のような形ですとtransformしている可能性が大です。例えばconfluentになるまで培養した場合、きちんとcontact inhibitionがかかって敷石状になりますでしょうか?そうであればtransformはしていないと思います。
また剥がれやすいとのことですが、昔飼っていた時の印象ですと、そんなに剥がれやすい細胞ではなかった印象があります。まあ、一口にNIH3T3といってもいろいろですから、由緒正しいものを得られるのが一番では。

培地 削除/引用
No.927-3 - 2008/04/07 (月) 19:56:21 - hatti
ご返信ありがとうございます。
ATCCには、10%CF(calf serum)/DMEMと書いてありましたが、
文献等ではFBSを使用しており、昔、実際に使っている方にもFBSでよいと
伺ったので、10%FBS/DMEMを使用しています。
形態は、やや細い様な気もします。

培地に問題があるのでしょうか?
よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用
No.927-2 - 2008/04/07 (月) 19:37:38 - a
3T3の形態はこの写真を参考に
http://www.atcc.org/Attachments/1825.jpg

培地は何を使っていますか?

NIH-3T3の培養について 削除/引用
No.927-1 - 2008/04/07 (月) 17:00:20 - hatti
最近、NIH-3T3細胞の培養を始めたものです。
コンフルエントにならないように気をつけながら培養していますが、
培地交換時に細胞が剥がれてしまい、困っています。
もともと、NIH-3T3が物理刺激に弱い細胞なのか、
または、形質変化してしまったのかが知りたく、投稿させていただきました。

よろしく、ご教授ください。

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