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ありがとうございます。 削除/引用 No.924-8 - 2008/04/08 (火) 09:54:11 - masamune 皆様、丁寧にアドバイスいただきありがとうございます。 ウエスタンブロッティングの方法をしっかり確認してみます。 自作抗体とは別に、毎回、他の抗体を使って、別のタンパク質を検出をしていますが、そちらは毎回きっちり検出されます。 またazideはいれていません。 血清を小分けにして冷凍保存しています。 新たに解凍したものを使ってもシグナルがでないことがあります。 サンプルは毎回新しいものを調整しています。

(無題) 削除/引用 No.924-6 - 2008/04/08 (火) 09:46:13 - sea すでに書かれているようにWBはたくさんの要素があるので 問題が起こると解決に時間がかかる場合が多いです。 が、まず以下の3点に問題を絞るべく、ご自身でチェックをされては いかがでしょうか？ (1) WB自体の系の再現性 (2) 抗体のconsistency (3) サンプルのconsistency --- (1) WB自体の系の再現性 大前提ですが、電気泳動、転写、一次抗体以外の抗体、検出系 はきちんと毎回workしているのでしょうか？ ほかの一次抗体を使ったときにはそのようなinconsistencyがない、 ということが確認できてますか？ できれば、電気泳動後のゲルの染色、転写後のメンブレンの染色、 同じ動物で作った別の一次抗体を使って行ったWBの結果、について 再現性をもった結果が得られるかどうか確認された方がいいと思います。 極論すれば、使用する試薬すべてについて安定性の問題が生じる 可能性があるわけですから。 (2) 抗体 抗体のinconsistency、という可能性については 以下の点はまずチェックが必要だと思います。 (a) azideを入れているかどうか (b) 保存に伴ってtiterが落ちていないかどうか (3) サンプル 毎回同じサンプルを使っているのかどうか、その場合 凍結解凍を繰り返していないか、 なども検討の必要があると思います。 理想はポジコンになるサンプルを取るときに calibration用に大量のaliquotを作って、 凍結解凍によるdegradationがどれくらいあるのか、 などまで調べることだと思います。 参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.924-5 - 2008/04/07 (月) 20:28:32 - A > また、現在、抗体は血清のものを使っています。 > 精製も考えた方がいいでしょうか？ 皆さんがおっしゃるように抗体以外の何かに問題があると 思われます。血清から抗体を精製するのはバックグラウンド が高かったり、免疫沈降に使ったりする場合かと思います。 ですからシグナルが得られたり得られなかったりという トラブルの解決を目的として行うのは適当ではないと思います。 もちろん精製した抗体が基本的にベターであることは否定 しませんが。各メーカーから販売されている抗体の取扱説明書 を見ると大体一番濃いのは1:100辺りです。但しこれはWBでは なくELIZAの場合です。あまり濃い抗体を使うとバックも上がり ますから今は現状の濃度で使用して現在のシグナルの得られない トラブルが解決してから適正な抗体濃度を決められては如何ですか。 過去にシグナルが得られたのであれば少なくとも現在の抗体濃度 でシグナルが得られるはずですから。

ありがとうございます 削除/引用 No.924-4 - 2008/04/07 (月) 17:51:37 - masamune 早速にメッセージを戴きありがとうございます。 現在1：500で使用しています。 どれくらいまで濃度を上げてもよいものでしょうか？ あまりあげるとバックが濃くなりますよね。 また、現在、抗体は血清のものを使っています。 精製も考えた方がいいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.924-3 - 2008/04/07 (月) 06:37:41 - おお WBは多段階の操作で、それぞれの操作がかなり結果に響いてきます。電気へいどうの分解能、ブロッティングの効率や質。この辺が毎回しっかり把握できているのがのぞましいです。 あとは、少し濃度を上げるとか工夫すると安定する事があります。総合的にいい条件を見つけてください。 もし、サンプルに精製したリコンビナントをかなりの量流しているならば、抗体としてはちょっと弱い(弱すぎる)可能性もあります。もし血清でやっているなら、精製して濃縮することも考えた方がいいかもしれません

(無題) 削除/引用 No.924-2 - 2008/04/07 (月) 01:57:56 - Q うまく行くときが２−３割あるのでしたら、なるべく終夜その抗体とある程度高い濃度でインキュベートするといいと思います。（やってなかったら） 厳密には、抗原抗体反応は非常にさまざまですので、条件、抗体の安定性などに左右されることはあります。抗体の安定とされますが、あくまでも一般論です。うまく行ったときの条件を正確にリピートしましょう。

自作抗体を使ってWBすると、バンドがでたりでなかったりします 削除/引用 No.924-1 - 2008/04/06 (日) 20:02:42 - masamune 自分でターゲットタンパク質の抗体を作成し、ウエスタンブロッティングを行いました。 　 すると、ある時はしっかりシグナルが検出されるのですが、また別の時には全くシグナルが検出されなかったりします。 　 これは一体何が原因なのでしょうか？ 使えない抗体ということなのでしょうか？ わかる方、ぜひとも教えてください。

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