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cDNAライブラリについて トピック削除
No.923-TOPIC - 2008/04/06 (日) 18:15:00 - Pumpkin
いつもお世話になっております。cDNAライブラリの作製について何度かご質問させていただいております。少々はまっておりまして。。。

clontechのSMART cDNA Synthesis kitで合成したcDNAにEcoR1アダプタを付けてリン酸化、サイズフラクションして、novagenのL_Screen ベクタに繋げてパッケージングしました。このときのcDNA:ベクタ比は50ng:0.5μgです。得られたtiterは5×10-6とやや高い形質転換効率を得ました。ホストセルはER1647です。

しかしながら、plaque direct PCRを行うとno insertのときのampliconが得られました(16/16)。驚異的な空ベクタの比率ですが、ベクタアームは脱リン酸化されており、かつサイズフラクションしていることからアダプター同士の連結体によるライゲートは起こらないはずです（とはいえ、armのみでのネガコンは未実施）。トラブルシューティングにはarmの量を減らせと書いてあるので、まずはそのようにしてみたいと思いますが、どこか致命的な間違いがありますでしょうか。御助言、よろしくお願いいたします。
　
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T4PNK 削除/引用
No.923-6 - 2008/04/07 (月) 07:29:39 - Pumpkin
おお様

ご返信ありがとう御座います。
T4PNKによるカイネーションの後は72℃,10分の熱処理に加えてEtOH沈したものを、以前このフォーラムでご紹介いただいたcDNAサイズフラクションカラム(Invitorogen)でサイズフラクションして使ってます。ですので、T4PNKのコンタミによるarmのセルフライゲートは大丈夫かと判断しております。

T様のご指摘にもありましたが、サイズフラクションは2回はしておりませんので、やはりアダプターが除去しきれていない可能性が一番大きいですよね。ただどうしてもdirect PCRの電気泳動結果が気になるので、シークエンスに回しつつ、各ステップを見直したいと思います。

(無題) 削除/引用
No.923-5 - 2008/04/07 (月) 06:17:09 - おお
知命的な間違いはないような気がします。
でも解決しないと前に進みませんので、、、
私も(下の様に)最初はアダプターがしたの理由でコンタミしているのではと疑ったのですが、PCRの結果からだとそうとも言えないようですね。燐酸化した時のPNK(カイネース)のコンタミは否定できますか?失活してなくてDNAとのアフィニティーがあったりして、ライブラリーと一緒にくっついてきて、ライゲーションのときATPが存在するので、ベクターを燐酸化したとか。もしそうならどこかで失活させる作業(フェノール、クロロフォルム、エタチン)を入れるといいと思います。


チョット気がかりなのは、アダプターが大過剰なので微量のアダプターのコンタミとかでしょうか、、サイズフラクションで少しリークしたとか。または、アダプターがついたcDNAの末端に、アダプターがアニールした状態でついてきた物が邪魔しているとかいう可能せいもなきにしもあらずです。
前者だと、クロマスピンにかける時の量を1割りぐらい減らす(むちゃくちゃすくなくは出来ませんが)か、代わりに電気えいどうでやってみるくらいでしょうか、、、
後者だとサイズフラクショネーションの直前に、45-50度位に温めるといいと思います。
経験がない者の想像ですので、単なる核心をついているか判りませんが、

(無題) 削除/引用
No.923-4 - 2008/04/06 (日) 21:24:06 - Ｔ
シークエンスした方がいいと思います。
意外とどちらでもなく、何らかのコンタミでベクターの末端が削れてセルフライゲーションしたものかもしれませんし。

アダプタダイマー 削除/引用
No.923-3 - 2008/04/06 (日) 19:54:20 - Pumpkin
T様

早速のご返答ありがとうございます。
Novagenのarmは脱リン酸化されているものとして販売されており、ネガコンをとってはいないとはいえ、ここまでひどい結果にはならないと思います。すると、やはりアダプタダイマーの可能性が一番多い気がします。ただし、アダプターダイマーの大きさが約30bpあります。全くのno insertで188bp、アダプタダイマーを噛んだとして218bpです。2.5%のアガロースゲルで電気泳動しているのですが、明らかにマーカーの200bpよりやや下に泳動されています。もちろん、マーカーとPCRバッファではバッファ組成が違うので多少の差は出てしまうと思いますが。

やはりダイレクトシークエンスで確かめた方が、いろいろ検討するよりも早いでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.923-2 - 2008/04/06 (日) 18:23:20 - Ｔ
その PCR プロダクトをシークエンスしてみれば、ベクターのセルフライゲーションかアダプターダイマーの残存かが明らかになるでしょう。

前者なら脱リン酸化の条件を見直す、後者ならサイズ分画を2回かけるなどが対処法として考えられます。

cDNAライブラリについて 削除/引用
No.923-1 - 2008/04/06 (日) 18:15:00 - Pumpkin
いつもお世話になっております。cDNAライブラリの作製について何度かご質問させていただいております。少々はまっておりまして。。。

clontechのSMART cDNA Synthesis kitで合成したcDNAにEcoR1アダプタを付けてリン酸化、サイズフラクションして、novagenのL_Screen ベクタに繋げてパッケージングしました。このときのcDNA:ベクタ比は50ng:0.5μgです。得られたtiterは5×10-6とやや高い形質転換効率を得ました。ホストセルはER1647です。

しかしながら、plaque direct PCRを行うとno insertのときのampliconが得られました(16/16)。驚異的な空ベクタの比率ですが、ベクタアームは脱リン酸化されており、かつサイズフラクションしていることからアダプター同士の連結体によるライゲートは起こらないはずです（とはいえ、armのみでのネガコンは未実施）。トラブルシューティングにはarmの量を減らせと書いてあるので、まずはそのようにしてみたいと思いますが、どこか致命的な間違いがありますでしょうか。御助言、よろしくお願いいたします。
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