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(無題) 削除/引用 No.921-6 - 2008/04/13 (日) 02:15:40 - PCR RT段階での変異に関しては、自分は気にしていませんでした・・・ ただ、調べると、結構変異があるんですね。 そう考えると、今までの結果が少し不安になってきました。 こういった考えなので、RT反応（cDNA合成）は比較的安値のものを使っていました。 QiagenやKURABOとか・・・ この会社を含めて、変異が多いとされる逆転写酵素の情報を知っている方は教えてください。 試薬の変更の参考にしたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.921-5 - 2008/04/07 (月) 10:42:02 - N >さとし様 貴重な体験談ありがとうございます。 やはりモノによって結構ちがうものなのですね。参考にいたします。 >おお様 確かにSNPsなどを考えると判断しづらい場面が出てきそうで、安易な判断は危険ですね。 この度はご回答いただきありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.921-4 - 2008/04/05 (土) 16:08:07 - おお http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=840 ここでMyさんがフィデリティーについてコメントを残してますね。 http://app.roche-biochem.jp/catalog/index.php/product_3.6.8.39.1.3.html 個人的には、PCRの正確性のほうが問題になると思いますが、5キロでしたら2つ拾えば必ず1つは正確なのが取れる(大抵2つとも一緒)ではないでしょうか。 RTは１度きりの反応ですのでPCRの様に変異が蓄積するわけではありませんし。 SNPsやエディッティングなどの問題もありますから、データーベースと違うから、または、2ツノクローンで配列が違ったから即ミューテーションと結論づけれないこともあると思いますが、、、

少しだけですが 削除/引用 No.921-2 - 2008/04/05 (土) 15:22:40 - さとし GeneRacer Kitに入っていた SuperScript IIIで結構変異が入りました。 ５つクローニングして変異が入った個数は 10/1300、3/1050、3/950、1/920、3/1000 な状態です。 RT条件がたまたままずかったのかもしれませんが Kitの取説通りにやってこんな結果でした。 タンパクのN末シークエンスと合わず、 ゲノムをクローニングするとcDNAと違いタンパクの配列とマッチする結果でした。 ReverTra Aceαでクローニングしなおしたのですが、 ゲノム配列と100%マッチしたcDNAがつれています。 上の５つは、全てにイントロンが入っていたので クローニングしたDNAの由来がゲノムかmRNAかは区別できています。 RT後やゲノムのPCRで使った酵素はすべてKOD plusです。 特に東洋紡信者ではないですよ？

RT酵素のfidelityについて 削除/引用 No.921-1 - 2008/04/05 (土) 13:13:59 - N いつも勉強させていただいております。 現在RT-PCRにより既知遺伝子のクローニングを行おうと思っています。 出入りの業者に、完全長cDNAを得るためのお勧めの酵素を聞いたところ、StratageneのAccuScriptというhigh fidelityを売りにしているRT酵素を教えていただきました。 そこで質問なのですが、RT-PCRでクローニングを行う際に、RT反応のfidelityが問題になるケースは結構あるものなのでしょうか？ また、何かお勧めのRT酵素などはございましたら教えていただけると幸いです。ちなみに目的mRNAのサイズは約5kbです。 よろしくお願いいたします。

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