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(無題) 削除/引用 No.906-7 - 2008/04/10 (木) 16:11:53 - 小心者 トランスフォーメーションの際にヒートショックをかけた後、抗生物質を含まないLBやSOCなどの培地でしばらく培養してからZeocin入りのプレートにまき出していますか？

形質転換効率 削除/引用 No.906-6 - 2008/04/08 (火) 15:15:09 - ぴちあん まろんさん 回答ありがとうございます。 私の場合と形質転換効率はかなり違いますね。 うまくいったベクターを頂きたいぐらいの感じですが、 そうもいかないので、 形質転換は一般的な方法と同じようなので 効率は悪いかもしれないですが、もう一度形質転換をやり直して 分子量が変わっていないプラスミドを抽出してみます。 ありがとうございました。

形質転換効率 削除/引用 No.906-5 - 2008/04/07 (月) 15:01:54 - まろん 形質転換効率については、SOC培地で１時間インキュベートしてからLow salt LB (pH7.5, Zeocin 25ug/ml)培地には種した場合、10の７乗以上でした。このとき、なぜか小さいコロニーがたくさん出ました（小さいものは形質転換効率の計算には入っていません）。形質転換方法はコンピテントセル（ニッポンジーン、ECOS Competent E.coli DH5a) のマニュアルに従っています。ただ、ヒートショック後、SOC培地を添加し、１時間ほど３７℃でインキュベートするようにしています。実験がうまく行くといいですね。

回答ありがとうございます。 削除/引用 No.906-4 - 2008/04/05 (土) 19:44:11 - ぴちあん まろんさん 回答ありがとうございます。 Invitrogenに問い合わせたところ そのようなトラブルの事例は無いと言われたのですが、 同じような経験をした方がいてちょっとうれしいです。 私の場合、pPICZ-Aは、５個プラスミドをとって ５個とも分子量が大きくなっていました。 もう一度形質転換をして 分子量が変わっていないプラスミドを抽出して使用しようと思います。 ちなみに、 まろんさんの場合形質転換効率はどのぐらいでしたか？ あと、形質転換は一般的な方法と同じですか？

(無題) 削除/引用 No.906-3 - 2008/04/04 (金) 17:01:35 - まろん コロニーが数個しか出ないことと、プラスミドの長さが違うことは別の問題だと思います。 私もプラスミドの長さについては同様の経験をしました。Invitrogenから購入したpPICZAを大腸菌に形質転換し、プラスミドを単離すると1kbpくらい長いものが取れました。そこで、１２個のクローンからプラスミドを単離したところ、９個は正しい長さでしたが、残り３個は長さの異なるものが取れました。制限酵素で切ってどの部分が長いのかを調べたところ、そのうち２つはEcoRVとBglII (pUCのOriの部分）断片が長くなっており、１つはEcoRVとBamHIの断片が２つあって片方が長くなっていました。正しい長さのものを選んで培養してみますと正しいもののみが取れてきますので、大腸菌の細胞内での変化ではないと思います。pPICZBやpPICZCではどうなのか調べたかったのですが、余裕がなくてできなかったのでそれらについてはわかりません。私は正しい長さのものを選んで使っています。

(無題) 削除/引用 No.906-2 - 2008/04/02 (水) 22:29:53 - B 1年ほど前にpPICZを使って発現系構築しましたが私の場合 大腸菌へのトランスフォーメーションで特に問題はありま せんでした。大腸菌はDH5aではなくTG1ですがぴちあんさんの トラブルが大腸菌の違いで起こっているとは思えません。 100ngの環状Plasmidを使ったのなら山ほどコロニーがでてくる はずですね。もう既に確認されているかもしれませんが私なら 1)他の過去にDH5aで問題のなかったことがわかっているplasmidを 使ってコンピテントセルの効率確認 1)'並行してZeocinの入っていないLow-Salt LBでのDH5aの培養確認 2)トランスフォーメーションに使ったplasmid（できればメーカー から買ったオリジナルのplasmid）と今回増やしたplasmidを同時に 制限酵素処理して同じゲル上に電気泳動。 3)pPICZのシークエンス確認 の順で確認すると思います。

酵母用タンパク発現ベクター (pPICZ) について。 削除/引用 No.906-1 - 2008/04/01 (火) 20:10:33 - ぴちあん 現在、Pichiaを用いてタンパク質発現を行おうとしています。 そのベクターとしてインビトロジェンのpPICZを使うのですが、 購入後、ベクターのストックを作っておこうと思い、 ベクター100ng分をDH5aにトランスフォーメーションしたところ、 コロニーが十数個しか生えてきませんでした。 この時点で形質転換効率が大分悪いなと思ったのですが、 液体培養をしてプラスミドを抽出しました。 そして、制限酵素で処理し、電気泳動で確認したところ、 元のベクターを処理したものに比べて1kbpぐらい大きくなっていました。 何サンプルかやりましたがすべて同じような感じでした。 ちなみに、 培養時のZeocinの濃度は25ug/mlでLow-Salt LBを使っています。 pPICZは大腸菌にトランスフォーメーションすると不安定なのでしょうか？ このような状況になったことがある方や、 対処法をご存じに方が居ましたら教えてください。 よろしくお願いします。

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