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(無題) 削除/引用 No.905-16 - 2008/04/04 (金) 13:11:58 - おお >[Re:15] 弘法さんは書きました : > これを10cmのプレート５枚にまき出すというのはあまりに濃すぎます。 私も多すぎると思います。

(無題) 削除/引用 No.905-15 - 2008/04/04 (金) 10:29:09 - 弘法 OD600が0.6ということはおおよそ10^7 cells/mlというところですので、この50ml分というと5x10^8 cells。これを10cmのプレート５枚にまき出すというのはあまりに濃すぎます。私なら少なくともその10倍の枚数を使います。

(無題) 削除/引用 No.905-14 - 2008/04/03 (木) 16:29:35 - KOVO >[Re:12] 弘法さんは書きました : > OD 0.6の何ml分を５枚（10cm径？）にまき出していますか。 すみません。 OD：0.6の50ml分を5枚に分けて巻いてますが…

(無題) 削除/引用 No.905-13 - 2008/04/02 (水) 14:11:01 - おお > プレイベクターがライブラリーでも空でも、 > 同じようにプレートが真っ白になってしまいます。 > これでも3-ATを入れる効果はあるのでしょうか？？ > 実は半年前にやったときは、きちんとセレクションがかかってうまくいっていました。半年たってコロニーが使えないということで再びやり直したらこのような現象。。。 3-ATはレポーターにHisを使う場合は有効です。Hisはleakyな場合が結構あり、3ーATでリークした分だけのHisをブロックして、スクリーニングする方法がとれます。ベイトなどのコンストラクトによってかなり3ーATの最適量が違ったりします。 "実は半年前にやったときは、きちんとセレクションがかかって、、、"とおっしゃってますので、同じベイトを用いてうまくいっていたのであれば実験系に問題がある可能性をまず疑うべきではないでしょうか。以前に使ったのと同じ株を使ってますか?同じ株でもたまたま変なクローンを拾っていませんか?ベイトをほりこんだときかもしれませんし、その前にクローンを拾って増やしたのであればその時かもしれません。またはなんかのコンタミで、そのコンタミがドミナントになってしまっているのかもしれませんね。 > > > ところで、ゲノムのライブラリーを使ってるんですね。プロカリオートをお使いなのでしょうか。 > ユーカリオートです！ 真核生物でゲノムということなので不思議に思いますが、、比較的イントロンが少ない、タンパクコード領域がゲノムのかなりを占める生物を使ってるのでしょうか、、、それかone hybridをされているような気もしますが、、、

(無題) 削除/引用 No.905-12 - 2008/04/02 (水) 12:50:18 - 弘法 OD 0.6の何ml分を５枚（10cm径？）にまき出していますか。 真核生物ならゲノムライブラリーではなく、cDNAライブラリーではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.905-11 - 2008/04/02 (水) 12:43:03 - KOVO >[Re:7] おおさんは書きました : > プレイに使われるからベクターをほり込み、セレクション用のプレートにまいてバックグランドを確認するのがいいかと思います。 プレイベクターがライブラリーでも空でも、 同じようにプレートが真っ白になってしまいます。 これでも3-ATを入れる効果はあるのでしょうか？？ > ところで、ゲノムのライブラリーを使ってるんですね。プロカリオートをお使いなのでしょうか。 ユーカリオートです！

(無題) 削除/引用 No.905-10 - 2008/04/02 (水) 12:31:16 - KOVO >[Re:6] Caspaseさんは書きました : > しばしばbaitタンパク質の構造によってはそれ単独でreporter遺伝子を活性化してしまうことがあります。 > ですのでbaitのみでreporter遺伝子の活性化を誘導しないことの確認を行う必要があるのですがこれは確認されたでしょうか。 実は半年前にやったときは、きちんとセレクションがかかってうまくいっていました。半年たってコロニーが使えないということで再びやり直したらこのような現象。。。 なので単独で活性化することは考えにくいかなと思ってます。 空のプレイべクターでも同じ症状がおきるため、確信は持てないですが… > システムは異なるかもしれませんが下記のクロンテック社のyeast hand bookを参照されると良いかと思います。 > http://clontech.takara-bio.co.jp/product/catalog/007003003.shtml ありがとうございます。さっそく参照してみます。

(無題) 削除/引用 No.905-9 - 2008/04/02 (水) 12:26:59 - KOVO >[Re:5] ~さんは書きました : > ベイト入りの酵母を、プレイを形質転換しないで同じセレクション用のプレートに撒いた場合には、コロニーは生えないのですか？ > プレイ用のヌルベクターを形質転換した場合はどうですか？ プレイに空のベクターを用いて形質転換しても症状は同じです。 プレートは毎回作り直しているのでプレートに原因があるとは考えにくいなと思ってます。 > （あれば、）ポジコンを入れたベイト入り酵母はどの位の時間でコロニーを作るのですか？ ベイト入り酵母は３日でコロニーを形成します。普通ですよね…

(無題) 削除/引用 No.905-8 - 2008/04/02 (水) 12:21:27 - KOVO >[Re:4] 弘法さんは書きました : > 生えてきた小さなコロニーや、「プレーティングした所全て（つまりプレート全体）が真っ白」というものの正体は、それらを楊枝などで突っついてYPDプレートにストリークしてみて、生えてきたシングルコロニーを顕微鏡で覗いてみることで分からないでしょうか。 やってみたいと思います。 > また、菌をまき過ぎていて死菌を栄養に菌がうっすら生えているだけなのかもしれません。どのくらいの菌数で形質転換をし、どのくらいのサイズ×枚数のプレートにまき出していますか。 ゲノムライブラリー1.5ugを用いて ベイト入り酵母のODが0.6になったものを形質転換し、 丸プレート5枚にまいてます。 まきすぎなんですかね？？ まく量をこの1/2、1/3にしても同じ現象が起きました。

(無題) 削除/引用 No.905-7 - 2008/04/02 (水) 08:49:08 - おお 私もこれは多分セレクションの条件かベイトによるものかと思えます。まずプレイに使われるからベクターをほり込み、セレクション用のプレートにまいてバックグランドを確認するのがいいかと思います。Hisでセレクションする場合は3ーATの濃度をふってバックグランドの抑えれる濃度を探れば良いかと思います。あとLacZのレポーターが入っている場合は、LacZの活性をプレイベクターをいれた物で見ておくと良いでしょう。LacZポジの場合は、ベイト単独でリポーター遺伝子を活性化しているか、ベイトのたんぱく質がプレイのADに直接結合してしまっている可能性も考えないといけないと思います。 バクテリアのコンタミにはアンピシリンやカナマイシンを入れて対処しているプロトコールを見たことがあります。 念のためプレイベクター(ライブラリー)を入れない物をネガコンとして平行にやれば幾らか具体的な情報が得られるような気がします。 ところで、ゲノムのライブラリーを使ってるんですね。プロカリオートをお使いなのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.905-6 - 2008/04/01 (火) 23:22:53 - Caspase しばしばbaitタンパク質の構造によってはそれ単独でreporter遺伝子を活性化してしまうことがあります。 ですのでbaitのみでreporter遺伝子の活性化を誘導しないことの確認を行う必要があるのですがこれは確認されたでしょうか。 活性化を誘導してしまう場合にはbaitの構造を変える、セレクションを強いもの条件に変える、3-ATを加えるなどの方法があります。 また、他の方の指摘にもありますが1plate辺りの撒く菌体数が多いのも悪い影響を与えます。 システムは異なるかもしれませんが下記のクロンテック社のyeast hand bookを参照されると良いかと思います。 http://clontech.takara-bio.co.jp/product/catalog/007003003.shtml

(無題) 削除/引用 No.905-5 - 2008/04/01 (火) 22:47:09 - ~ セレクション用のプレートの問題のような気がするのですが‥ 本当の問題は、コロニーが早くできることではなく、増えてきた酵母が当たりではない可能性が高いということですよね。 ベイト入りの酵母を、プレイを形質転換しないで同じセレクション用のプレートに撒いた場合には、コロニーは生えないのですか？ プレイ用のヌルベクターを形質転換した場合はどうですか？ （あれば、）ポジコンを入れたベイト入り酵母はどの位の時間でコロニーを作るのですか？ 適当にストリークして、シングルクローンを取った場合、 取れたクローンにはそれぞれ別のプレイが入っているのですか？ ポジコンがコンタミしていたりしませんか？

(無題) 削除/引用 No.905-4 - 2008/04/01 (火) 21:43:33 - 弘法 生えてきた小さなコロニーや、「プレーティングした所全て（つまりプレート全体）が真っ白」というものの正体は、それらを楊枝などで突っついてYPDプレートにストリークしてみて、生えてきたシングルコロニーを顕微鏡で覗いてみることで分からないでしょうか。 また、菌をまき過ぎていて死菌を栄養に菌がうっすら生えているだけなのかもしれません。どのくらいの菌数で形質転換をし、どのくらいのサイズ×枚数のプレートにまき出していますか。

(無題) 削除/引用 No.905-3 - 2008/04/01 (火) 21:12:45 - KOVO >[Re:2] 弘法さんは書きました : > 培地か試薬か水がコンタミしている可能性はありませんか。アンピシリンは酵母に効かないので、最後の手段として酵母の培地にアンピシリンを加えるという手もあります。 書き込みありがとうございます。 私もコンタミかもしれないと思って顕微鏡で培地を見た所、 酵母が綺麗に分裂しているものばかりで コンタミのような形跡は見られませんでした。 やはり顕微鏡だけではコンタミしてないとは断定できないのでしょうか？ アンピシリンを加える件は今度試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.905-2 - 2008/04/01 (火) 20:22:54 - 弘法 培地か試薬か水がコンタミしている可能性はありませんか。アンピシリンは酵母に効かないので、最後の手段として酵母の培地にアンピシリンを加えるという手もあります。

Two-Hybrid Screening トラブル 削除/引用 No.905-1 - 2008/04/01 (火) 20:07:35 - ＫＯＶＯ 現在、酵母TwoHybridScreeningを行っています。 ベイトを形質転換した後、 ベイトの目的蛋白質の発現をウェスタンで確認した後、 プレイのゲノムライブラリーを形質転換しました。 通常、酵母は２〜３日でコロニーが生えてくるはずですが なぜか私が形質転換すると翌日には とても小さなコロニーが生えてたり 2日もすれば、プレーティングした所全て （つまりプレート全体）が真っ白になります。 この原因がまったく分からず1ヶ月ほど立ち往生しています。。。 なにかご存知の方、アドバイスある方、 ぜひ書き込みお願いします。

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