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ありがとうございました 削除/引用 No.904-10 - 2008/04/13 (日) 00:55:04 - ＴＸ おおさん ご指摘ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.904-9 - 2008/04/12 (土) 17:53:06 - おお >3’からのシークエンスは5’よりも波形が汚いので >コンタミしているゲノムが非特異的に増幅されているとかんがえられますが cDNAを3'から読む時、polyA(裏から読むのでシーケンス上はpolyT)が邪魔をすることがあります。polyTやATリッチな配列はシーケンスしにくい配列です。コンタミしているゲノムがどうこうとかいうよりは、ゲノムにせよmRNAにせよ、オリゴdTで拾ってきてますので、3'はATリッチな配列で始まっていると思います。コンタミと関係づける根拠はあまりないと思います。

ご指摘有難うございました。 削除/引用 No.904-8 - 2008/04/12 (土) 16:26:21 - TX caspaseさん、おおさん、ａさん、中年さん ご指摘有難うございます。 また、返事が遅れまして申し訳ありません。 cDNAライブラリーは、クロンテックから購入した ヒトのcDNAライブラリーです。 マニュアルを調べてみるとどうも ｃＤＮＡは、DNase消化せず oligo dTを用いて作製しているようです。 従って皆様からご指摘頂いたように、 コンタミしたゲノムによりアーティフィシャルな タンパク質が発現し釣れたようです。 候補クローンを再テストする前シークエンスしたんですが ゲノムとエクソンの非翻訳部位が多いこと。 また、この際問題が生じました。 5'からのシークエンスで同一遺伝子が複数釣れてきたのですが これら全てのクローン3’から読めないという現象が生じました。 3’からのシークエンスは5’よりも波形が汚いので コンタミしているゲノムが非特異的に増幅されているとかんがえられますが 読めている遺伝子もあるんです、、、。これはどのように解釈すればよいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.904-7 - 2008/04/02 (水) 19:39:04 - 中年 試しにblastxを掛けてみてはどうですか？ また、生物種は何ですか？

(無題) 削除/引用 No.904-6 - 2008/04/02 (水) 14:14:59 - a 同じ配列を持つクローンは複数ありましたか？ あと、ライブラリは市販品ですか？それとも自作ですか？ 私なら、 同じ配列を持つものが1クローンだけなら、ゲノムのコンタミがたまたま釣れただけかもしれないので、棄却します 数クローンが同じ配列を持っているなら、詳しく調べてみる かな？

(無題) 削除/引用 No.904-5 - 2008/04/02 (水) 10:52:16 - おお この段階で言えることは2点です。 1)データーベースにはないが、実際にRNAが合成されていて、その配列をもとにイーストで合成されたポリペプチドが相互作用した。 2)ゲノムDNAがライブラリーにコンタミしていてそれが何らかの理由でひっかっかた。 もしその配列に興味があるのであれば、まずはライブラリーのソースか、それに近い組織や細胞からRNAをとり発現をみるのは手だと思います。で発現が認められなければアーティファクトの可能性が高いのでプライオリティーは下がると思います。 その配列はイントロンとおもえるスキップがありますか?

(無題) 削除/引用 No.904-4 - 2008/04/01 (火) 23:28:56 - Caspase 得られたクローンがESTやunknown proteinをコードしている場合もあるでしょう。 たまたまベクターに組み込まれたゲノミックDNAによりアーティフィシャルなタンパク質が発現されている可能性もあるかと思いますがいかがでしょうか。

誤解を与えてしまいすいません 削除/引用 No.904-3 - 2008/04/01 (火) 21:45:10 - TX すいません、タイトル文章ともに誤解を与える書き方をしてしまいました。 正確には プレイのインサートシークエンスの結果をもとに、 Blast searchしたのですが、一部のクローンはmRNAがヒットせず、 genomic conting,alternative assemblyしかヒットしません。 これは調べ方が悪いのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.904-2 - 2008/04/01 (火) 19:59:52 - え？ タンパク質だってゲノムにコードされているのですよ。

two-hybridでゲノムがヒット 削除/引用 No.904-1 - 2008/04/01 (火) 19:55:30 - ＴＸ 現在、yeast-two hybridをおこなっているのですが、 プレイのインサートシークエンスで疑問に思ったことが あるので質問します。 ベイトと相互作用すると予想されるプレイのインサートを シークエンスし、blast searchしました。 ベイトとプレイはプロティンープロティン相互作用を 見ているはずなのに、なぜか一部のクローンは genome conting,alternative assemblyがヒットします。 これはなぜでしょうか？

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