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ありがとうございました 削除/引用 No.902-7 - 2008/04/02 (水) 20:56:40 - もへじ EDTAを加えてシークエンスしてみましたところ，ノイズはずいぶん減少しました．今まではエタノール濃度も高すぎだったようです（８０％）． スピンカラムは手持ちのものがなかったのと，かなりの量を扱っていることもあるのでとりあえず試しませんでした．LPA，おもしろそうなので今購入中です．アドバイスをどうもありがとうございました．

(無題) 削除/引用 No.902-6 - 2008/04/01 (火) 13:08:43 - LPA 言い忘れましたが、そうするとおまけにシグナルがこれまでの何倍も強くなり、マニュアルにあるエタ沈条件ではかなりのロスがあったことが分かりました。

(無題) 削除/引用 No.902-5 - 2008/04/01 (火) 13:07:29 - LPA 添付のマニュアルのエタ沈条件ではかなりの頻度でdyeのピークが出たので、うちでは共沈剤としてLPAを加えて、エタノール添加後すぐに室温で遠心するようにしたら問題が解決しました。

あ、ちょうど 削除/引用 No.902-4 - 2008/04/01 (火) 12:23:52 - ema うちもBigdye1.1,3.1でやってるんですが数百検体もやってるとときどきそうゆう現象がおこりました。 理由はFreeのDyeでしたので、 １；G50を自分で96プレートつめゲル精製で規定量の２倍（そこまでいってるのは規定量ではとりきれませんでした） ２；それでもだめなものはSeqかける前にEDTA+SDSで95℃Heat （いちおう各工程別に予備実験して結論） ABIのトラブルシュートに出ている方法でとりあえず。 少し手間かかりますが、約2000検体のうち問題サンプル400くらい大半レスキューあきらめたのは3でした。

(無題) 削除/引用 No.902-3 - 2008/04/01 (火) 11:58:22 - おお フリーのダイの影響かと思います。共沈の可能性と、少ないボリュームでやっているため、除き切れなかったかでしょうね。Gー25とかのスピンカラムでもいいかと思いますが。 あとはわざとボリュームをあげて、酢酸アンモニウムで沈殿するとかでもいいかと思いますが、、 エタチンのあとの洗いを2回やるだけでも違ってくるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.902-2 - 2008/04/01 (火) 10:46:04 - ~ 私は特に困ったことが無いのですが、 http://www.gelifesciences.co.jp/newsletter/oligo_mail/oligo15.asp ではEDTAも加えてエタ沈すると、フリーのダイの共沈が抑えられるようです。

シークエンスのノイズ 削除/引用 No.902-1 - 2008/04/01 (火) 06:03:39 - もへじ BigDyeを用いてDNAシークエンスをしております．サンプルはミニプレップあとのプラスミドです．PCR反応後はエタノール沈澱をしてキャピラリー電気泳動にて配列確認をしています． 反応もうまくいっており配列もほとんどきれいに読めているのですが．いつも７０塩基あたりと１７０塩基あたりに大きなノイズが入ってしまい困っております． ぐぐってみたところ，ABのサイトでBigDye XTerminator精製キットを使えばノイズがなくなるとのことですが，これ以外の方法でこのノイズをなくす方法をご存知の方いらっしゃいましたらアドバイスお願いします．

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