全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.900-9 - 2008/04/04 (金) 12:29:14 - よしかわ どうやら原因は大腸菌のようです。 AD494でNusを発現させてみると、確かに可溶性画分に発現が確認できました。 AD494はもう販売していないのですが、コンピじゃないものを他の研究室の方からもらったので、とりあえずコンピ化させてから目的の蛋白を発現させてみたいと思います。 また最もスタンダードなBL21でもやってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.900-8 - 2008/04/03 (木) 11:38:23 - L Origami株はチオレドキシンレダクターゼとグルタチオンレダクターゼに変異を持たせる、大腸菌内の環境を酸化的に保たせることで、 ジスルフィドがかかりやすいという特徴を持っています。 もしかすると、参加的条件下では目的タンパク質の安定性が損なわれているのかも？と考えたのですが、 これはNus単独でも不溶性になる理由にはなりませんね。 pET43.1で検索してみると、BL21(DE3)で発現させることも可能のようですね。

>A 削除/引用 No.900-7 - 2008/04/02 (水) 19:18:20 - よしかわ CBB染色で見る限り大きさ的にNusだと思われます。抗Nus抗体はもっているので確認することは出来ます。時間が許せばやってみたいと思います。 リフォールディングについてですが、今回発現させようとしている蛋白はウイルスのヌクレオカプシドプロテインなのでSS結合は関係なさそうです…。すみません↓ また、今回用いたOrigami(DE3)はSS結合が効率よく行われるという特徴があるそうです。なので、この余計な機能が可溶性にむしろ悪影響を与えているのかもしれません・・・。

>L 削除/引用 No.900-6 - 2008/04/02 (水) 19:07:20 - よしかわ 私が参考にしている論文によると、同じような蛋白をpET43.1とAD494という大腸菌で発現させていました。ただAD494は現在発売していないとのことです。 実はAD494に空のpET43.1を取り込ませた大腸菌を発見したので、Origamiと同じ手技で蛋白抽出を行ってみます。

(無題) 削除/引用 No.900-5 - 2008/04/02 (水) 16:29:27 - A もう既に確認を取っているかもしれませんがメーカーには 相談されました？空ベクターで発現した不溶性蛋白質の 分子量がNusのものなのかも含め確認が必要かと思います。 もし空ベクターで発現した蛋白質がNusらしいのであれば 今使われている発現条件に根本的な問題があるかも しれませんから。 目的の蛋白質はウイルス由来ということですがその蛋白質に 関するSS結合の存在や発現後の修飾（N末のアミノ基の修飾や 糖付加など）についての情報はないのですか？よしかわさんが 大腸菌で発現させようとしているところから発現後の修飾に ついてはないと思いますが、SS結合がないのであればリフォー ルディングを諦めるのは早いかと思います。目的の蛋白質を 封入体から回収する場合もちろんリフォールディングが必要 ですが、封入体だけを回収することによって既に80%に近い 精製度の蛋白質が得られますし目的蛋白質がプロテアーゼなどに より分解されることを防げます。

(無題) 削除/引用 No.900-4 - 2008/04/02 (水) 13:09:07 - L >pET43.1のカタログによるとOrigami(DE3)は発現用大腸菌として優れていると記載されていたのですが…。 それは困りましたね。 pET43.1を使って発現を試みている論文では、ホストはOrigamiなんでしょうか？ BL21だとうまくいったなどの報告があればいいですね。 １つ確認したいのですが、 インサートあり／なしの可溶性／不溶性画分に抗-Nus抗体を用いてwesternで確認してみましたか？ それでがっちり不溶性に出ているならば、引き際を考えるべきかもです。

＞L 削除/引用 No.900-3 - 2008/04/01 (火) 19:50:54 - よしかわ 尿素などで無理矢理溶かすことも考えているのですが、リフォールディングがうまくいくか心配です。発現させようとしている蛋白質がウイルスの蛋白質で、今後抗原性等について検討して行こうとしているためです。また、尿素を取り除いた際に再び不溶性になる可能性もあります。このへんはやってみないとわからないので、試す価値はありますが。 あと、pET43.1のカタログによるとOrigami(DE3)は発現用大腸菌として優れていると記載されていたのですが…。 引き際が大切でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.900-2 - 2008/04/01 (火) 12:04:47 - L pET43.1とOrigami(DE3)の相性が悪いのではないでしょうか？ 可能であれば菌株を変えるか、vectorを変えるか、またはその両方を試してみてはいかがでしょうか。 そうでなければ、アルギニンや種々のdetergentで可溶化の検討となります。

蛋白質の発現〜Nus融合蛋白〜について 削除/引用 No.900-1 - 2008/03/31 (月) 17:37:31 - よしかわ ある蛋白質を可溶性に発現させる目的で、pET43.1ベクターを用いました。 これは目的の蛋白質のN末側にNus-tagを融合させることで可溶性を高めるものです。 大腸菌はOrigami(DE3)を用い、IPTG添加、20℃で発現誘導を行いましたが、ほとんど不溶性分画に見られました。 ちなみに、空ベクターを用いて同じように実験したところ、何故かNus(と思われる)までも不溶性に発現していました。 これは一体どういうことなのでしょうか？

全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---