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(無題) 削除/引用 No.892-8 - 2008/04/01 (火) 21:27:17 - カナマイシン >変な二次構造をとったプローブが核タンパクと結合していたとしても、その後の泳動の際にプローブの二次構造を改善できるのですか？初めて伺いました。プローブは変な二次構造をとっていても、正常に結合すべき核タンパクと結合するのでしょうか？ 言われてみればそうですね（笑）。 他の目的があって泳動バッファー系を変更したのですが （ノンスペバンドは論文でも「ノンスペ」と書いてしまおうと思っていた）、 期せずしてよくなったように記憶しております。 いま手元に資料がないのでなんとも言えないのですが･･･すみません。 ただその時思ったのは、 ・変な二次構造をとったプローブは蛋白と結合しない 　（私の場合、その「ノンスペ」はプローブのみのレーンにも蛋白加えたレーンにも 　シフトせず同じだけ見えていた）。 ・泳動バッファー系によっては、アプライしてから流し始めた瞬間までの間に 　二次構造が軽減されることがある。 なんて考えて納得してました。今思い返すと自信はありません。 そして私が普段使うプローブは 100 bp 前後です。 短い方が二次構造を取りやすいのか取りにくいのかはわからないです。 他の皆様、どうでしょうか？ ちなみにもし二次構造を疑うのなら、定法であれば 泳動バッファー系の変更よりも反応バッファー系の変更かもしれませんね。 塩濃度が効きそうな気がします。 もっとも、塩濃度は蛋白-DNA間の結合にも効きそうなので注意が必要ですが。

(無題) 削除/引用 No.892-7 - 2008/03/31 (月) 14:07:52 - A もう一つお聞きしても宜しいでしょうか。 ＞そういえば私も昔似たような経験をしたような気がしてきました。 そのときは 4. で解決したと思います。理由は説明できませんが。 バッファー系を変えるとネガコンのバンドシフトがなくなったということですか？ 改善したときは、核蛋白を加えている方のバンドの位置はどうなりましたか、変わりましたか？ 色々聞いてすみません、よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.892-6 - 2008/03/31 (月) 14:02:41 - A いろいろとご助言ありがとうございます。 ＞2. アニールからやり直してみる。 アニールは一度やりなおしてみたのですが、アガロースで確認した所、どちらも同じように薄い２本目のバンドがみえていました…。 ＞4. ゲルシフトのゲル−泳動バッファー系を変更し、二次構造改善をはかる。 　（たとえばいまTAEをお使いならTBEとかTGEとか）。 変な二次構造をとったプローブが核タンパクと結合していたとしても、その後の泳動の際にプローブの二次構造を改善できるのですか？初めて伺いました。プローブは変な二次構造をとっていても、正常に結合すべき核タンパクと結合するのでしょうか？ ＞ちなみに今お使いの ・ゲル−泳動バッファー系の種類 ・オリゴの長さ ・プローブのラベル法 は何でしょうか？　その情報によってはまた思いつくかもしれません。 泳動はTBE系で、オリゴの長さは22merです。プローブのラベル法は、ロシュのキットを用いてDIGで標識しています。 どうぞよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.892-5 - 2008/03/31 (月) 13:39:08 - カナマイシン 補足ですが私なら4231の順に試しそうな感じです。

(無題) 削除/引用 No.892-4 - 2008/03/31 (月) 13:37:51 - カナマイシン 記述を拝見する限りやはりプローブのコンタミが疑われるような気がします。 アガロースゲルに流して微量でも二重に見えたのなら、ますます心配です。 コンタミ、といっても、 ・目的と別のオリゴが混ざっている可能性 の他に、 ・アニール失敗等で変な二次構造を取っている可能性 もあると思います。 私なら･･･ 1. オリゴが安い（そして古い）なら買い直してみる。 2. アニールからやり直してみる。 3. アガロースゲルの切り出し精製をしてみる（薄い別バンドが混ざらないように）。 4. ゲルシフトのゲル−泳動バッファー系を変更し、二次構造改善をはかる。 　（たとえばいまTAEをお使いならTBEとかTGEとか）。 そういえば私も昔似たような経験をしたような気がしてきました。 そのときは 4. で解決したと思います。理由は説明できませんが。 ちなみに今お使いの ・ゲル−泳動バッファー系の種類 ・オリゴの長さ ・プローブのラベル法 は何でしょうか？　その情報によってはまた思いつくかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.892-3 - 2008/03/31 (月) 11:26:38 - A 位置は中央辺りで、フリープローブとは別の位置に出ています（フリープローブは一番下に出ています）。この中央のバンドが、核抽出液を入れたときに見えるバンドと全く違う位置に出ているならまだいいのですが、かなり近い位置に出ているので（５�oほどずれているだけです）…。 濃さはタンパクーDNA複合体のバンドシフトと同じ位に結構見えています。 ゲルへのアプライはかなり慎重にやっており、量もレーンの半分くらいしかアプライしていないので、混入したということはまずないです。 以前別の研究室で同じような手法でゲルシフトをやっていたときはこのような経験はなかったので、購入したオリゴヌクレオチド（別の人が一年ほど前に既に購入していた）がおかしいのか、と思っているのですが…センスとアンチセンスをアニーリングした後にアガロースゲルでバンドを確認した際に、二本鎖DNAのバンドが主要な一本と、もう一本薄いバンドがすぐ上に見えていたのが気になっています。かなり薄いバンドだったのでそのときは無視してしまいました。 購入したオリゴヌクレオチドは必ず純粋なものなのでしょうか？簡単に変性したりするものですか？ 購入し直した方がよいのか迷っています。 何かお気づきの点がありましたら、どうかよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.892-2 - 2008/03/31 (月) 09:41:54 - つん どんな位置にバンドがみられるのでしょうか？ バンドの濃さはどうですか？ フリーのプローブについて言っているわけではないですよね？ 核抽出液を入れたときと同じような位置にバンドが見えるのでしょうか？ ゲルにアプライするときに、隣のレーンに加えた核抽出液がネガコンのレーンに混入してしまったなんてことなないでしょうか？ アプライする量が多かったり、アプライの仕方が雑だったりするとありえます。

ゲルシフトのネガコンでの問題 削除/引用 No.892-1 - 2008/03/30 (日) 07:45:12 - A ゲルシフトのネガティブコントロール（extractの含まれないプローブと結合バッファーのみ）の反応で毎回バンドのシフトが見られ、原因がよくわかりません…。核タンパクを加えた反応では少し位置のずれた似たような場所にバンドシフトが見られるのですが、ネガコンがこのような状態では、このシフトを信用していいものかどうか分かりません…。 購入したオリゴヌクレオチドが変性していたのでしょうか？ どういったことが原因と考えられるのかお分かりの方がいましたら、どうかよろしくお願いいたします。

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