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(無題) 削除/引用 No.891-3 - 2008/03/30 (日) 16:57:27 - 通りすがり ホルマリンやパラホルムアルデヒドなどでの固定は backgroundが高くなり現実的にはタンパク同士の相互作用の 検出は困難です。 またDNAとタンパクの間も架橋してしまい核内の因子などの場合 タンパク間の相互作用でなくDNAを介したものとして擬陽性のものを検出する可能性が非常に高いです。 それと架橋を完全にはずすときにかなり苦労し、 最終的に電気泳動などしたときにうまく分離しないことも多いです。 下のかたの書いてある通り純粋なタンパク同士の相互作用の検出の場合 DTBPやらDMPあるいはDSPなどを使用することが多いです、 ただし目的はわかりませんが論文などを作ることなどを目的とする場合、 必ずレフリーにこれらの処理なしでも、相互作用が検出できることを示すよう 求められます。 すなわちほとんどの場合これらで架橋しなくても非常に弱くは検出はできるが、架橋した場合強く検出できるようになり目的とする結論にsupportiveとなるためこのような処理を行ったという理由付けでの場合のみ許される方法です。 全く架橋無しでは検出できない場合に、これらを行ってもただのartifactとみなされ相手にされないことが多いのです。

(無題) 削除/引用 No.891-2 - 2008/03/30 (日) 13:03:53 - 名無し 免疫沈降するにあたって、架橋して複合体を安定化するのが目的ならピアス社とかいろいろなところから、それ用にいろんな架橋剤（膜透過性で生きた細胞内で架橋できるDSPとか、架橋が可逆的なやつとかいろいろある）が売られているからそれ使った方がいいとおもう。やり方も書いてあるし実際にそれを使った文献も載ってる。ホルマリンはアルデヒドで反応性高いから蛋白質を非特異的にいろいろ修飾しそうだし、実際、抗原性を変化させてしまう（抗体が認識しなくなる）場合がよくあるし、あまり良い選択ではないとおもう。抗体はポリクローナルの方がいいと思う。エピトープがマスクされたり、結合する蛋白質でじゃまされて抗体がアクセスしにくくなったりして、上手くいかないときがあるから。

固定→免沈 削除/引用 No.891-1 - 2008/03/30 (日) 00:28:32 - reiko ホルマリン等で細胞を固定した後、免疫沈降して蛋白質間のinteractionを調べたいと 思っています。 参考になる論文やプロトコルなどを教えて頂けないでしょうか？ 宜しくお願いします。

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