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初代培養肝細胞の凍結保存 トピック削除
No.876-TOPIC - 2008/03/26 (水) 10:37:49 - ジェス
高価な機器（プログラムフリーザー等）を使用せずに（ラット等の）初代培養肝細胞を凍結保存をする方法をご存知でしたら、教えて下さい。
有用な方法が記されている論文情報でも構いません。
多くの方法が論文化されていますが、どれが有用かイマイチよく分かりません。
論文に記されているいくつかの方法を試してみましたが、うまくいきませんでした。
よろしくお願い致します。
　
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No.876-4 - 2008/03/26 (水) 15:33:14 - おお
なるほど、p450などの生理活性が必要なわけですね。肝細胞の機能は培養後急速に失われてしまうと記憶しています。１度けいだいするだけでも機能はほとんど失われるぐらいではなかったでしょうか。ですから単離して凍結するだけでも可也ストレスがかかってますので機能をどこまで維持できるのかなと思ったりもしますが、恐らくそのような実験系を組んでいる文献を見られて、実験されているのだと察します。
細胞を起こした直後の細胞がトレパンブルーで見積もって高い生存率(90%以上)でしたら、起こしたあとの培養のコンディションで何とかなるような気もします。ディッシュはコラーゲンコートとかしたのをお使いでしょうか?もし使ってなければ試すのもてかと思いますが。
私は凍結には100%の血清にDMSO10%を添加しています。たいていの細胞は血清だけの方が調子いいです。ATCCに載っている細胞はたいてい5%DMSOで保存と書いていますので、DMSOの濃度も最適な濃度があるかもしれませんね。

もし起こした時にトレパンブルーで可也死んでいるようでしたら、やはり凍結の仕方とか考えないといけないでしょうね。単離直後の細胞はディッシュについて機能しますか?単利の仕方も、すぐに培養に移すよりももっとマイルドにした方がいいかもしれませんね。

あまりその様な実験にタッチしたことのない人間のアドバイスなので参考にならなかったら聞き流してください。

(無題) 削除/引用
No.876-3 - 2008/03/26 (水) 14:48:31 - ジェス
早速のご返答ありがとうございました。

ご指摘の方法（発砲スチロールに入れる、紙をぐるぐる巻きにする、イソプロパノールを使う方法⇒NalgeneのFreezing containerを使用）で行いましたが、うまくいきませんでした。
その他に、セルバンカーを使う、FBS濃度を上げてみる等々行いました。
ラボでは他のセルラインもしくはembryonic fibroblastでは簡単に凍結保存できている現状があります。

ちなみにここで言う「うまくいく」というのは細胞がプレート上に接着し、ある種の薬物代謝酵素誘導剤でちゃんとP450の発現が誘導されることを意味しています。
市販化されているヒトの凍結初代培養肝細胞でもなかなか接着しないものが多いです。
肝細胞（特に初代培養系）はグリコーゲンやタンパク・脂質が細胞質中に豊富にあるので、それが凍結保存を難しくしているのではないか、と考えています。
どちらかというとセルライン系の凍結保存法よりも受精卵の凍結保存法の方が適しているのではないか、と個人的に感じています。

受精卵の超急速凍結に使われるようなDAP213を凍結保存液として肝細胞を凍結保存されたことのある方はいませんかねぇ？（⇒自分でやってみれば良いのですが）

(無題) 削除/引用
No.876-2 - 2008/03/26 (水) 13:33:36 - おお

> 論文に記されているいくつかの方法を試してみましたが、うまくいきませんでした。
> よろしくお願い致します。
どんな方法を試したか書いた方が、アドバイスをもらいやすいのではと思います。


最近は細胞凍結のために、こんな物まで使うのかと驚きです。確かに医療用の卵とか細胞だとこういうのがいるかもしれません。
初代肝細胞ということですが、多分普通の細胞の凍結方法で大丈夫かと思います。急速に凍らないように徐々に温度を下げて行くために、発泡スチロールの箱に細胞の入ったチュ-ブを入れ、発泡スチロールの箱ごとディープフリーザーに入れるとか、チューブをペーパータオル4、5枚つかってぐるぐる巻きにして、テープで止めて、ビニール袋とかに入れてディープフリーザーに入れると大抵は大丈夫かと思います。
もう少し気の聞いたものだと、細胞凍結用の容器が売っていると思います。円い容器で、二重底になっていて、下の部分にイソプロピルアルコールを入れるようになっていて、そのうえにチューブを支えるラックみたいなのを置けるようになっています。イソプロパノールがディープフリーザーで冷える速度が丁度いいようです。

この方法で全くダメだったら、多分プログラムフリーザーを使ってもあまりうまく行かないと思います。何か根本的におかしい所があると思います。
というのはプログラムフリーザーがラボに導入され出したのはここ数年のことで、その前までは上記の方法で大抵の細胞(初代の物を含め)は凍結されていましたから。

初代培養肝細胞の凍結保存 削除/引用
No.876-1 - 2008/03/26 (水) 10:37:49 - ジェス
高価な機器（プログラムフリーザー等）を使用せずに（ラット等の）初代培養肝細胞を凍結保存をする方法をご存知でしたら、教えて下さい。
有用な方法が記されている論文情報でも構いません。
多くの方法が論文化されていますが、どれが有用かイマイチよく分かりません。
論文に記されているいくつかの方法を試してみましたが、うまくいきませんでした。
よろしくお願い致します。
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