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NP40　1%no 削除/引用 No.874-9 - 2008/03/31 (月) 15:46:23 - western

(無題) 削除/引用 No.874-8 - 2008/03/31 (月) 14:52:02 - western おお様： RIPA bufferは、25 Tris, 150 NaCl,1 EGTA, 1 EDTA (mM), 0.5 Deoxycholate, 0.1 SDS, 0.1 NP40 (%)です。 おお様のおっしゃるように、Deoxycholateなしのバッファーも検討してみようかと思います。粗細胞骨格画分ですので、核マトリックスなども混在してると思いますし、中間経・アクチンフィラメントもかなり多いのではないかと思います。自分の見たいタンパク質は、細胞骨格に結合しているものなので、それらはばらつきなく抽出されている気がしますので、あまり心配しなくても良いように思えました。 どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.874-7 - 2008/03/30 (日) 12:45:51 - おお RIPA bufferはデオキシコール酸をお使いでしょうか?デオキシコール酸は酸性領域で溶けませんので、ひょっとしてサンプルバファー(pH6.8)の影響でデオキシコール酸が沈殿した、あるいはし始めているかもしれません。でもこれは推測です。デオキシコール酸の代わりにCHAPSをつかうか、いっその事除いてしまっていいのではないでしょうか。濃度によりますが、細胞をRIPAなので溶かすと僅かですが濁っているような気がすることはあります。でも溶けるべきものはすべて溶けているという前提で実験しています。溶けないもの、溶けにくいものは核マトリクスを構成しているようなもの、中間径フィラメントなどです。よく分かりませんが、こういうものは若干の濁りの原因にはなるかもしれません。大事なのは、比較するサンプル間で、タンパクの濃度とかのバリエーションを最低限に抑えて、抽出条件を一定にする事かもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.874-6 - 2008/03/30 (日) 12:24:46 - western レスが遅くなりまして、申し訳ありませんでした。 ats, おお様： Kは、Lysis bufferには入ってませんので、それによるものではないと思っているのですが。 A様： 凝集しやすいかどうかはちょっとわかりませんが、ボイルした直後も濁っているので、徐々に凝集しているという感じでもないです。 小出しするつもりはなかったのですが、私のやっている具体的なサンプリング方法をお伝えした方が、みなさまにご助言を頂けそうなので、お示しします。 問題となる細胞溶解液は、粗細胞骨格画分です。プロトコールは、 1.1% tiriton, 5 mM EGTA, 50 mM Tris溶液で、細胞を溶解 2.遠心後、上清を除き、ペレットにRIPA bufferを加える。 3.チップソニケーターでペレットを分散 4.3X sample bufferを加えて、5minボイルする 1% tritonに溶けない画分なので、それなりに溶けにくい画分だとは思うのですが、サンプルバッファーにまで溶けないものかと思っています。 何か気づく点などありましたら、お願いします。

(無題) 削除/引用 No.874-5 - 2008/03/29 (土) 14:37:57 - おお あ、ほかの方がいわれているようにカリウムは沈殿の原因になります。SDSサンプルバッファーを加える前に透明で、加えたあと濁るなら細胞溶解ようのバッファーとサンプルバッファーとの相性を考えた方がいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.874-4 - 2008/03/29 (土) 14:33:05 - おお >サンプルバッファーにはほぼ全てのタンパク質が溶ける これについてはそう考えても良いかと思います。 1グラムのたんぱく質につくSDSは1.4-2.0グラムぐらいといわれていますので、お示しの濃度のたんぱく質でサンプルバッファーに溶けているのであれば、脂質などにもSDSが作用することを考えてもじゅうぶんSDSがあると考えてもいいかと思います。 でも、溶けないものがあるかどうかについては、溶けないタンパクはあります。これはそのたんぱく質の性質によるものですので、そういうものを考慮に入れないで良いなら、ほぼすべて溶解していると思って良いと思います。ただ、遠心はした方がスッキリはしますね。溶けない特別なたんぱく質やその他の物を除くということを考えれば。 もし、SDSのキャパ以上にたんぱく質があった場合、熱変性でたんぱく質が沈殿してしまうこともあるかと思いますが、今回はそうではないと思います。

(無題) 削除/引用 No.874-3 - 2008/03/25 (火) 18:39:04 - ats lysateに K（カリウム）やグアニジン塩が入っているとSDSと沈殿を形成しますヨ。 念のため。

(無題) 削除/引用 No.874-2 - 2008/03/25 (火) 16:56:20 - A 過去にサンプルバッファーと混合、煮沸して直後にゲルに のせたところ直ぐに沈殿が現れたことがあります。これは その蛋白質が凝集しやすく安定して溶解するために温度が 関係してしていたからのようです（サンプルは2つのバンド にまで精製したサンプル）。ですからwesternさんのサンプル も私の場合と同じようにサンプルが凝集しやすいのでは？

サンプルバッファー混和後のサンプルの透明度 削除/引用 No.874-1 - 2008/03/25 (火) 14:42:07 - western いつも大変参考にさせてもらっております。 Western blotting用のサンプルについての質問です。 培養細胞のlysateを調製し、サンプルバッファーに混和後、煮沸、ゲルへローディングしています。この際、遠心などによるdebriの除去はしていません。 これまで、サンプルバッファーにはほぼ全てのタンパク質が溶けるものだと（勝手に）思っていたのですが、溶液の透明度を見ると、濁りが見えます。これは、タンパク質が完全に可溶化されていないのか、膜脂質成分が濁りを見せているのか、どちらなのでしょうか？ もしタンパク質だとしたら、実験結果の真偽に関わるのかと思って、これまでの実験の結果についても少し不安になっています。 ちなみに、タンパク質濃度は、BCA法で最終濃度（サンプルバッファー混和後）が1500-2000ug/mL程度です。 ご意見よろしくお願いします。

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