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(無題) 削除/引用 No.867-2 - 2008/03/24 (月) 21:27:31 - 名無し そのTAP-tagならN末なら、Protein A-TEV切断配列-CaMBPー自分の蛋白質という順番、C末なら、自分の蛋白質ーCaMBP-TEV切断-Protein Gという順番だと思うというかそう習ったすごい前だけど。だからIgG-resinからの溶出はふつうTEV proteaseでやると思う。そうすればIgGの混入は無いか、仮にあってもレムリbufferでやるよりは全然少ないと思う。 でもどうしてもそういうことはやりたくなくてやっぱりSDS bufferで溶出したいということなら、IgG resinを使用前にpH2.5くらいのグリシンーHCl bufferで軽くwashして（ちゃんとresinに共有結合できていないような、あとで混入するであろうIgGを除くため。pH2くらいのbufferにすこしくらい曝してもIgGはそんな簡単には変にならない。）、それから平衡化して使用すれば、IgGの混入は0にはできないけどかなりのところまで減らせる。 IgGに結合しやすい蛋白質は細胞のなかには割とあって、これだけではあまり綺麗にはならない事が多いけど濃縮だけならいいかもしれない。精製でなくて濃縮が目的で、変性してもいいなら、なにもTAP-tagでなくても、たとえばHis-tagとかの方がいいのではないかとおもう。

IP: IgGのコンタミ回避 削除/引用 No.867-1 - 2008/03/23 (日) 06:20:28 - ntr お世話になっております。 TAP tag（IgG-binding unit, calmodulin binding peptide, TEV)が付いた 目的タンパク質をIgG sepharoseでpull downしています。目的はCoIPでは なく、単にTAP付きタンパク質を濃縮するだけなので、洗いは強い条件で 行うことも可能です。今回最終的に泳動用のサンプルバッファーで溶出した ところビーズに固定されているはずのIgGが大量に溶出されました。 DTTは加えておりません。IgGがビーズから遊離してこず、且つIgGから 目的タンパク質を乖離させるようなウォッシュ等、もし何か良い方法が ありましたら是非ご指導宜しくお願いいたします。

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