全16件 ( 1 〜 16 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

ありがとうございます 削除/引用 No.866-16 - 2008/04/13 (日) 01:32:30 - PCR ~さん、ありがとうございます。 今回の目的とするpromoter領域は、GCrichではなかったことと、 実験の目的上、正確さを重点をおいた酵素を使用する予定です。 会社については、なんとか皆さんがお勧めのものにしようかと思っています。 あと、何回か話が出てますが、ベタインやDMSOのことに関しては、知りませんでした。教科書や先輩の助言も全くなかったもので・・・初耳でした。 原理に関しては、詳しく調べてみるつもりですが、仮にまたうまくいかない場合には、参考にし、ぜひとも利用したいと思います。 また何かありましたら、宜しくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.866-15 - 2008/04/12 (土) 16:19:31 - ~ Planinum pfxしか使ったことがありませんが、 約5kbのベクター中の配列約2kb(一部GC rich)を増やすのに、 MgSO4とEnahncer solutionでマトリクスを組んで条件検討をしてようやく増やせたことがあるので、 個人的にはpfxもう使う気はありません。 AccuPrimeもPlatinumも両方ともpfxはインビトロジェンのHPでGCリッチ向きではない(スコアが低い)ですよね。 気難しい酵素だと考えています。 そのため、もし自分でInvitrogen社製品で実験する必要があれば、 プロモーターは変な構造をとって増えにくいような気がするので、 AccuPrime GC-Rich DNA Polymeraseで2kb x 2でクローニングしようとすると思います。

(無題) 削除/引用 No.866-14 - 2008/04/12 (土) 14:18:57 - ats >[Re:12] mugimakiさんは書きました : > KOD plus ver2.0をもっぱら使い、GC richの時は > カナマイシンさんがおっしゃられているようにベダインを入れて対応します。 わたしもベダイン大好きなKODplus派？ですが、 KOD plus ver2＋ベタインはpoint mutationが入った経験があります。KOD plus ver1＋ベタインでは変異が入った経験はありません。 GCrichな場合は、メーカー推奨のKOD plus ver2＋DMSO(5-10%、ただし超特級グレード)をお奨めします。 ver2は増幅量が多くて好きなのですが、DMSOの扱いがやや面倒。 DMSOは水分を吸いやすいので注意しましょう。小分けして4℃保存で固体にならなければ捨てましょう。

お勧めは・・・ 削除/引用 No.866-13 - 2008/04/12 (土) 08:40:58 - PCR みなさま、ご回答ありがとうございました。 色々と検討していますが、サイクル数などは30cycle程度で見えるようにしたいので、フェデリティーが高いものを検討しています。 酵素に関しては、4kbpになるので、Taqよりもミスが少ないとされている酵素を使う予定なのですが、皆さんが進められているものよりも、invitrogenの試薬が手に入りやすい状況なのですが、Pfxなどはどうなのでしょうか？ もし何か情報があれば教えてください。

(無題) 削除/引用 No.866-12 - 2008/04/03 (木) 09:32:26 - mugimaki TAKARAの酵素を使用している方が結構おおいのですね。 うちではもっぱらKOD(TOYOBO)を使用しています。 回し者ではありません・・・念のため。 KOD plus ver2.0をもっぱら使い、GC richの時は カナマイシンさんがおっしゃられているようにベダインを入れて対応します。 GC richにはKOD Fxがいいことになっていますが、PCR errorが気になります。 plusの方で気になったことは今までありません。 TAKARAを使用する場合はLA taqが多いかな。 参考になれば幸いです。

訂正 削除/引用 No.866-11 - 2008/03/24 (月) 00:23:52 - カナマイシン 読み直して間違いに気付きました。 誤）終濃度0.5% ベタイン 正）終濃度0.5 M ベタイン すみません。訂正いたします。

(無題) 削除/引用 No.866-10 - 2008/03/23 (日) 11:21:55 - MP 私もけっしてTakaraの回し者ではないですが、今まで使った酵素の中では、増幅性、特異性ともPrimeSTARがベストです。その他ではPfu Turbo、Pfu Ultraあたりも悪くはないと思います。

(無題) 削除/引用 No.866-9 - 2008/03/23 (日) 02:19:56 - MM 以前マウスゲノムからいくつかの領域（最大で6.5kb）を増幅したときは、Pyrobestがアメリカで手に入らないのでPhusionを用い、問題なく増幅 できました。全長シーケンスしてもエラーはなしでした。 extentionは1kbあたり20秒だったかな？普通のtaqより早いです。 サイクル数は25-30くらいで回してました。 Pfuは何度か試しましたが、うまくいった試しがないです・・・

(無題) 削除/引用 No.866-8 - 2008/03/22 (土) 16:00:54 - カナマイシン 最初の行に「困ったことはない」と書いてしまいましたが、言い過ぎました（笑）。 困ったことは何度もあります。 PrimeStarとPyrobestの比較で甲乙つけがたい、ということで判断をお願いします。

(無題) 削除/引用 No.866-7 - 2008/03/22 (土) 15:59:43 - カナマイシン 私もPrimeStar派です。以前Pyrobestでしたがそれでも困ったことはないです。 そして（以前どっかに書きましたが）熱烈なベタイン信者です。 終濃度0.5% 。エラーが入ったことは覚えている限りありません。 サイクルは30。それで見えなければ大抵ダメ、と思っています。 我々の扱っている生物もGCリッチの関係でゲノムからの増幅が難しいとされているのですが、 ベタインでほぼ増えてます。本当にベタインのおかげかはわからないですが。 ただ、個人的には LA taq with GC Buffer より PrimeStar with Betain の方が ことごとく成績がいいです。あまり長い断片を増やしてないせいかもしれませんが。 特段の事情のない限り 2 kb に抑えてます。でも 5 kbでも成功してます。 そう、どうしても増えないときは、 ・増幅したい配列の中に存在しない制限酵素でクロモソームを完全切断。 →アガロース電気泳動（ラダーに見える）。 →自分の欲しい断片が含まれているであろう位置を計算し、 　おおまかでいいので切り出し。 →ゲル溶出。 →溶出液をテンプレにPCR。 で成功したこともあります。 まあ実質問題、2 kb × 2 本 ないし 1.4 kb × 3 本にわけてクローニングすると思います。 どのみちその後エラーチェックをすることを考えれば、です。

(無題) 削除/引用 No.866-6 - 2008/03/22 (土) 15:41:26 - おお あ、そうだ40はたしかに回しすぎだとおもいます。テンプレートのDNA量にも気を配ってください。とくにゲノムは複雑性が高いので、過剰に入れない方がいいです。10ngぐらいを目安にしてください。プライマーも少なめの方が特異性が高いようです。 あと40も回すということはノンスペも何も出てない状況でしょうか? アニーリングの温度を下げていき、特異的なものいがいでもいいですからバンドが出るぐらいの条件を探ると、どういじった方がいいか考えやすいですし、複数バンドが出ても、目的のバンドが切り出せれば何とかなるはずです。ゲノムも違った材料から取るとPCRを阻害するもののコンタミの量とか変わってきて、かかるサンプルがあるかもしれません。 あと、精製方法ですが、飽和ウレア(約12Mぐらい)を等量加えてからエタチンするとすこぶる綺麗になるようです。ここでどなたかに教えてもらったことがあります。

(無題) 削除/引用 No.866-5 - 2008/03/22 (土) 14:38:27 - ~ クローニングで40サイクルは回しすぎのような気がします。 増えにくいようなら、GC%に関係なくLA-taq with GC bufferを使ってます。 これもタカラですね。 Pfuは前にマグネシウム濃度を検討しないと増えなかったことがあるため、 あまり好みではありません。 (そのときにLA-taqは1回で増えたので、LA-taqが好みです)

追記 削除/引用 No.866-4 - 2008/03/22 (土) 12:27:31 - 一産婦人科医 今まで山のようにクローニングしてシークエンスにまわしていますが、増幅配列内にエラーがあったことは一度もありません。（もう既に延べ50万塩基は超えていると思う） TAKARAの回し者ではありませんが良いですよ、PrimeStar。

(無題) 削除/引用 No.866-3 - 2008/03/22 (土) 12:23:47 - おお 私だと、Pfuとかピロベスト(タカラ)を使います。PfuとTaqのブレンドされたものでもいいかもしれません。DMSO(10%ぐらい)は念のため加えることが多いです。プライマーは30マー以上で設定し、シャトル(アニーリングと伸長を68度、変性96度ぐらい)でPCRをかけます。タカラLAーTaqもかかると思いますが、ミューテーションの頻度が少し高いきがしますので第１選択にしていません。 伸長反応は4分ぐらいでも良いと思いますが、完全に伸長させるために長めに設定する人もいるようです。ゲノムからだとサンプルの複雑性が高いので、ネスティドで特異性を上げるとかいうのもてかと思います。 タッチダウンを使う人もいますがそれだと少しプライマーは短い方がいいでしょうね。 ゲノムからPCRせずに、目的の配列を含むファージやBacなど手に入れるとかかりやすいことが多いのではと思います。 4kbpsはそんなに長くはありませんが、間に制限酵素とかつかえそうな場所があれば2つに分けてもいいかもしれません。制限酵素のサイトがなくても分けて後でつなげれる方法が何種類かありますが、それはそれでその最適条件も探さないといけない可能性がありますので、とりあえずはコメントしません。

(無題) 削除/引用 No.866-2 - 2008/03/22 (土) 12:19:12 - 一産婦人科医 TAKARAのPrimeSterが一番良いです。

PCR酵素 削除/引用 No.866-1 - 2008/03/22 (土) 11:47:05 - PCR 現在、promoter領域のサブクローニングを行なう予定ですが、 PCRにて目的配列のDNAを増幅させようとしています。 ただ、通常のPCR（目的配列1kbpまで）に用いる酵素では、目的のサイズのDNAが得られません。 皆さんは、このように長い配列の増幅のときは、どのようにしていますか? お勧めのキットか酵素はご存知でしょうか？ ちなみに、目的配列のサイズは約4kbbで、40cycleでextension timeは４分で行なっています。 回答していただけるとありがたいです

全16件 ( 1 〜 16 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---