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(無題) 削除/引用 No.860-20 - 2008/04/03 (木) 00:14:13 - MY A549であれば、FugeneHDが良いのではないのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.860-19 - 2008/03/31 (月) 23:35:22 - 双子 本当にご助言いただいた方々ありがとうございました！ 勉強になりました。 A549にリポ２０００で導入のことですが、ラボ内伺ったところ、トランスフェクション用A549を扱う先輩方々がみんなリポ２０００断念だそうです。私のいるラボでは、A５４９にりぽ２０００が無理だということは確かなんです。これは少しでもご参考になれば幸いだと思います。

(無題) 削除/引用 No.860-18 - 2008/03/31 (月) 10:44:52 - ~ 今後、同じようにトランスフェクション効率を上げたいという人がここを見れば、培地量の変更も試そうとするかも知れませんので、 何で問題が解決したのかを書くことは有効だと考えています。 効率の上昇の原因が、リポソームと細胞の接触頻度の上昇なのか、リポソームの構造維持（薄まると壊れる？）なのか、別の理由なのかは分かりません。 リン酸カルシウム法では、トランスフェクション時に普段の培養時よりも培地量を減らしてインキュベートすると効率が上がるそうなので、同じ効果が得られているのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.860-17 - 2008/03/30 (日) 00:46:04 - 双子 ウェルずつ血清と抗生物質不含の培地の量です。普通６ウェルなら、ウェルずつ培地を２ml入れますが、その２mlの量を８００μlに変えたら、嘘のように導入効率ががらりと変わっちゃったんです。その理由はわかりません。培地の量の減少による複合体と細胞との十分になる接触だったかな。 ~さん、どう思われますか？

(無題) 削除/引用 No.860-16 - 2008/03/29 (土) 17:13:34 - ~ 何のパラメーターでしたか？

やった！リポ２０００じゃないのだけど．．． 削除/引用 No.860-15 - 2008/03/29 (土) 14:29:22 - 双子 リポ２０００をそのままにしておいて、PCFC-PEIにはとりあえずパラメーターの一つを変えちゃって見ればと思って変えたら、一転十分納得できる導入効率を得ました！わずかな毒性だし、本番の実験用の導入剤はPCFC-PEIにしみてもいいように思われます。 みなさん、本当にありがとうございました！皆さんの助けてくださったからこそ頑張ってきたから。

(無題) 削除/引用 No.860-14 - 2008/03/26 (水) 15:05:26 - A549er ちょうどこの細胞を使って研究しています。 LipofectAMINE LTXにplus reagentを足して用いると、 毒性がほとんどなく、効率５０％ぐらいになる系があります。 あとこの細胞、アデノウイルスの感染効率がとってもよく、 細胞も感染に強いので、うちではウイルスでノックダウンしてます。

(無題) 削除/引用 No.860-13 - 2008/03/26 (水) 07:35:20 - おお DNA：導入剤の比率　DNA:lipo2000 1:1.5と1:2.5 これはどっちが毒性がつよいですか? それによって考え方を変えた方がいいかもしれません。 思い切ってリポフェクタミン2000を0.5とか0.3ぐらいにしてみてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.860-12 - 2008/03/26 (水) 07:31:39 - おお リポフェクタミン2000は少量の血清が入ったバイチでもそこそこの導入効率が得られたと思います。 血清を含まないバイチでDNAとリポフェクタミン2000をミックスしておいて、 細胞は0.1から1%の血清が入ったバイチ(ただしこうせいぶっしつぬき)に変えて、DNAリポフェクタミンミックスを加えるのもてです。

もう一度やりましたが．．． 削除/引用 No.860-11 - 2008/03/26 (水) 01:19:15 - 双子 パラメーターは下記のとおりです 蒔くときの培地：血清と抗生物質入り トランスフェクション用の培地：血清と抗生物質フリ ＧＦＰ発見プラスミド量：ウェルずつ１μg DNA：導入剤の比率　DNA:lipo2000 1:1.5と1:2.5　DNA:PCFC-PEI 1:1 インキュベーションの時間：３０分 トランスフェクション後6時間で普通の増殖用バイチに変える それに、今回は例の先輩のご協力で実行していただいたんです（洗浄そのあとから）。が、lipo2000の場合は、光る細胞の７割ぐらいが死滅、(残る３割が生きてくれてありがたい）導入効率３０％程度で、PCFC-PEIの場合は、光る細胞がひとつか二つか．．．先輩の最高記録が４０％−５０％なのに．．．どうしても納得できません。 ガン細胞の継代による遺伝子の変異はよくあるそうですが、まさか私のA549はこっそり毒性に弱くなるような遺伝子の変異がおこったりしないのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.860-10 - 2008/03/22 (土) 15:20:34 - おお 実験にもよりますが、細胞の数を多めにすると毒性が軽減されることがあります。あとはよく入る細胞ならトランスフェクションご6時間ぐらいでバイチを普通の増殖用バイチに変えても大丈夫です。非常によく入る物は3時間でも行けるような気がします。DNAとリポフェクタミン2000を混ぜたあとのインキュベーションの時間が短すぎると毒性が強くなることがあるようですが、マニュアルに書いている通りにやっていればまずは問題ないです。大事をみて少し長めに取ってみるのもてかもしれません。毒性のない状態で効率をみて、それで納得が行かないようであれば別のものを使うのもてです。フュージーン6あたりは毒性もそんなに強くなくよく入る感触はあります。

(無題) 削除/引用 No.860-9 - 2008/03/22 (土) 15:06:05 - ~ >３対照として別の試薬を一緒に用いたが、導入した細胞が死んでいなかったんです 私ならば、この結果を元にDNAの純度は気にしません。 洗浄の他に、 DNA量を1/2ずつ希釈したり、処理時間を数時間ずつ減らしていって、毒性や形質転換頻度を見ていくこともできると思います。 その先輩の条件でshRNA発現ベクターを入れたことがある人はラボにいないのですか？ わざわざA549に入れているということは、単にノックダウンできるshRNA配列かどうかを見るためでなく、 何らかの反応を見たいのですよね。 それは40~50%の導入効率では駄目なのでしょうか？ すでに起きている現象が起きなくなるというであれば、減っただけでは見にくいと思いますが、 普段起きていない現象が起こるというのであれば、40~50%でも見ることができると思います。 また、transientで実験する必要はあるのですか？ shRNA発現EGFPベクターを入れて、FACSでEGFP発現細胞を取ってきたり、 薬剤耐性を使ってでセレクションすることで、 マスカルチャーやシングルクローンを取ってくることができると思いますが、 それでは駄目ですか？

検討しました．．． 削除/引用 No.860-7 - 2008/03/22 (土) 00:48:08 - 双子 みんなさんのご助言ありがとうございます。 実験場の先輩たちの経験でいうと、確かlipo2000はほかの導入剤と比べて毒性は高い、でも導入した細胞全滅まではちょっと．．．、やっぱり私の操作になにか迂闊なところがありましたよね。 で、整理、検討した結果 １トランスフェクション時の前１時間、蒔いてあった６wellplateでの継代用培地（血清と抗生部質入り）をトランスフェクション用の培地(血清と抗生物質フリ）に切り替えただけ、洗ったことがないので、もしかして残った少量の抗生物質と血清が細胞死の原因の一部のように思います。 ２DNA（GFP発見プラスミド）は各ウェルに同じ２μg、DNAとlipo2000の比率は１：１から１：２．５まで試したんです。 ３対照として別の試薬を一緒に用いたが、導入した細胞が死んでいなかったんです。DNAには問題がないと判断できますか。 しかし、そのPCFC-PEIという試薬は導入効率がlipo2000よりかなり低下で、光る細胞が疎らでさびしくて、lipo2000の場合は星空のように輝いていますけど（効率５０％）、細胞死滅には無念です。ある先輩の経験によりますと、PCFC-PEIの効率は最適化した条件でも４０−５０％までですが、shRNA干渉実験のためのtransientトランスフェクションの場合には大丈夫でしょうか。 初心者なので質問が多いんですみません。 どうぞよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.860-6 - 2008/03/21 (金) 18:58:01 - 通りすがり とりあえずまっさきにやるべきことはDNAか試薬のどちらに原因があるいか調べるために、DNAなしの状態でLipo2000単独でやってみましょう。 一応、経験的なことでいうとLipo2000は毒性は高いです、はっきりいって。 しかし、抗生物質の有無や血清不含の状態での時間あるいはDNAの精製度 を上げたり、DNAとlipo2000の比率を最適化したりするなどの工夫で毒性を減少させることはできます、ただし、それでも通常の他のtrasnfectionの試薬と比べて死ぬ細胞は明らかに多いのでそこはあらかじめ認識しておいたほうがいいです。 実際にやる場面としては、他の試薬で試して導入効率が悪いときにこれを選ぶという感じで第一の選択肢として選ぶべき試薬ではないです。 ただ、他の試薬では全く入らない場合にLipo2000だけは入るということが経験上あるのでその場合、どれぐらいの毒性は許容できるか また実験の目的に影響しないかの判断で用いることが多いです。

(無題) 削除/引用 No.860-5 - 2008/03/21 (金) 18:05:49 - Eire 抗生物質入りの培地を使っていませんか？ 細胞によっては抗生物質存在下で Lipofectamine 2000 を加えると、細胞死を引き起こすことがあるようです。 トランスフェクション用の培地には抗生物質を含まないものを用い、継代用培地に抗生物質が入っている場合は、細胞を抗生物質を含まない培地で一度洗ってから、抗生物質を含まない培地に再懸濁して蒔き直せば改善されるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.860-4 - 2008/03/21 (金) 12:33:02 - ~ Google検索すると、複数のilpofectaminでA539に入れた論文がヒットするので、双子さんの操作の問題のような気がするのですが… http://www.invitrogen.co.jp/products/molecular_biology/11668111.pdf メーカーはshRNAを入れることが出来ていると書いていますが、 これと(DNA,RNA以外の)条件が同じでも死ぬのですか？ 他の論文の条件ではどうですか？ 入れようとしているベクターが汚いために死んでいるということはありませんか？ 処理時間やリポフェクタミン濃度が０であれば毒性は出ようがありませんよね。 時間を短く、または濃度を薄めてみてはいかがでしょうか？ 他の試薬や遺伝子導入法を使うことは出来ませんか？

(無題) 削除/引用 No.860-3 - 2008/03/21 (金) 12:30:50 - PD A549は使ったことありませんが，DNAなしでも死滅しますか？ それと，焦っているのはわかりますが，ちゃんと読み直してから投稿したほうが良いと思います．

A549にリポフェクタミン２０００でＤＮA導入、毒性がひどい 削除/引用 No.860-1 - 2008/03/21 (金) 12:09:49 - 双子 A549細胞株にＧＦＰタンパク発見プラスミドをトランスフェクションの試薬中ですが、DNA:リポ２０００がどんな比例でも、６wellplateの細胞がほとんど死滅です．．． よく光る細胞が小さく丸くになっていました。 普通のきれいな形を保ていないんです。 変形した細胞が培養液のうわべに浮いてるトコから見ると、多分もう死滅に違いない。 リポフェクタミン２０００による毒性が原因ではないでしょうかと思われます。 今すごく困っています、このままだと、予定のRNA干渉用のshRNA発見プラスミド導入が話にならなくなるんです。 なにかアドバイスをいただけたらうれしく思います。 どうぞ、よろしくお願いします。

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