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(無題) 削除/引用 No.856-7 - 2008/03/20 (木) 17:56:08 - kon 仕事中様、a様、おお様 詳しい回答を頂きありがとうございました。 GST融合タンパク質では、Nativeと性質が異なる場合があるのですね。 まだまだ勉強が足りないので、もっと勉強したいと思います。 まずは皆さんのアドバイスを参考に、GSTを切断して酵素の性質を確かめてみます。また、その他の要因についても調べてみたいと思います。 本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.856-5 - 2008/03/20 (木) 15:09:31 - おお 2つの要因を考えないといけません。GSTとは関係なくリコンビナントであるために起こり得ることと、GSTがついているために起こりうることです。 まず後者ですが、GSTがつくことにより、やはり構造の歪が出来たり、基質のアクセスを妨害したりという可能性は十分あり得ると思います。特にGSTはホモオリゴマーを形成していると思いますので、目的のタンパクもオリゴマーになるならば、そういう性質は制限される可能せいがあります。N末にたぶんGSTをつけていると思いますから、C末に6xHISというのを別に作成して性質を比べるのもてかもしれませんし、GSTの部分を切断できるなら、１度切断して切断していないのと比べて、GSTが邪魔しているか確認してみればいいと思います。 もうひとつの(前者の)可能性ですが、リコンビナントですからやはりネイティブと違う環境で合成されています。ですから色んな不備みたいなのが出てきうるわけです。部分的に(場合によっては全体的に)3次構造が違う可能せい。適切な修飾がなされない(リン酸化、糖修飾、脂質などの付加、プロセッシング(n末やc末がネイティブの状態では除去されているとか)、プロリンイロメラーゼの関与、モノユビキチネーション、アセチレーション、メチレーション、、挙げたら切りがないですね)、未知のコファクターの欠乏などの可能性があると思います。 逆にリコンビナントの活性が従来そのタンパク質単独の活性で、ネイティブのタンパク質は周りの環境によりその活性がモディファイされている可能性もあるかも知れません。

(無題) 削除/引用 No.856-4 - 2008/03/20 (木) 14:27:48 - a 最近のベクターならEKやprecision配列が入っていますので、GSTを切断することも可能ですが。 我々は、GST fusionであるproteaseを精製しました。fusionでは活性はありませんでしたが、EKでfusion部分を切り離したら、活性が戻りました。

recombinantとNativeとの違いでは？ 削除/引用 No.856-3 - 2008/03/20 (木) 12:10:52 - 仕事中 GST融合蛋白質に限らず、Nativeの配列を元に作製したrecombinantが活性を持っていないことはあります。アミノ酸配列が同じでも立体構造が同じとは限らないからです。また大腸菌で発現させたrecombinantには糖などの付加はおきませんし。 また同じrecombinantでもGST付きとGST除去とでも活性に差異が見られることも十分にありえます。

組換え蛋白質 削除/引用 No.856-2 - 2008/03/20 (木) 12:01:05 - 仕事中

GSTタンパク質の性質について 削除/引用 No.856-1 - 2008/03/20 (木) 07:39:18 - kon 実験書をたよりに実験している状況で、まわりに遺伝子や組み換えたんぱく質について聞ける人がいないので教えていただけると幸いです。 ある酵素たんぱく質を精製し、そのアミノ酸配列を元にGST融合タンパク質を作成しました。 Glutathioneアガロースを使ってシングルバンドになるまで精製し酵素の性質を調べたのですが、もとの酵素と基質特異性など性質が異なっていることがわかりました。 GST融合タンパク質はGSTのない場合と機能等異なる場合があるのでしょうか？ 実験書や文献を調べてはみたのです調べ方が悪いのかわかりませんでした。 よろしくお願いします。

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