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(無題) 削除/引用 No.853-5 - 2008/03/21 (金) 13:00:20 - AP >これはAの発現量が最も多いと考えるのがよいのでしょうか？ つまり、同じプライマーセットでA, B, Cの競合PCRをしたということになると思いますが、 競合PCRで、もとの鋳型量比に応じた産物量比になるのは、どの鋳型種も増幅効率に差がないことが前提です。長さの違いや配列の違いによって増幅効率は違ってきますので、Aが優先的に増えたというのが、量が多かったからか、量に差はなかったけれどBやCが増えにくい配列で競合に負けたのかはわからないではありませんか。 事実Aがほかより豊富だったとしても、その結果を根拠に主張するなら信用されないでしょう。 >（PCRではA,B,C間にあまり差がなかったのですが）。 ここでいうPCRがどのようにおこなわれたのかが問題だと思います。 定量・半定量ができるように適正に配慮されていれば良いですが、 プライマーセットが異なる、ターゲット配列や長さが異なるなど条件が違えば、増幅効率も当然違ってきます。 本当は量が少ないものでも、たまたま他より増えやすい条件だったり、増幅が飽和するまでPCRをかけてたりすれば、産物量に差が見られなくなることはあります。

(無題) 削除/引用 No.853-4 - 2008/03/21 (金) 12:50:02 - う〜んと PCR産物を（クローニングしないで）シーケンス反応の鋳型に用いたということですよね？ その個体の遺伝子A、B、Cに対して、PCR効率に偏りがないことを確認していればAが多く発現しているという解釈でいいと思います。 ただし3種類の配列が混ざって波形データに出てくるので、実際の配列とシーケンサの波形を見てみないと確信はできませんが。 A,B,Cに特異的なPCRプライマーを設計する方が安心ですね。 昔はカスタムPCRプライマー合成が高価でシーケンス反応の方が相対的に安価だったのでこういう実験系も組まれたんだろうと思いますが、今は状況が変わってますね。

(無題) 削除/引用 No.853-3 - 2008/03/20 (木) 19:05:29 - 塩基 すいません、図がずれてました。 各プライマーは過去の論文より作成しました。 Isoformがある領域が100-200だとするとセンスプライマーとアンチセンスでその領域を挟んでます（1-300）。

(無題) 削除/引用 No.853-2 - 2008/03/20 (木) 16:48:56 - a > あるDNAで下図のように特定の塩基配列（約100bp）のみに差があるA,B,Cのisoformが存在します。各臓器での発現の差を確認するためにそれぞれのプライマーを作成してPCRを行いました。 それぞれのプライマーとは、A,B,Cを特異的に認識するプライマーですか？ プライマーの特異性はどのように確認しましたか？ > このとき差のある部位を挟んだセンスーアンチセンスでのシークエンスがisoform　Aの配列と一致しておりました。 すべてのアイソフォームを増幅するプライマーでのPCR productをシークエンスしたということでしょうか？

isoformのシークエンスの違い 削除/引用 No.853-1 - 2008/03/20 (木) 07:11:43 - 塩基 いつも参考にしております。 あるDNAで下図のように特定の塩基配列（約100bp）のみに差があるA,B,Cのisoformが存在します。各臓器での発現の差を確認するためにそれぞれのプライマーを作成してPCRを行いました。 センスーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーアンチセンス 　　　　　　　　　Aーーーーーーーーーーー　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　B−−−−ーーーーーーー 　　　　　　　　　Cーーーーーーーーーーー このとき差のある部位を挟んだセンスーアンチセンスでのシークエンスがisoform　Aの配列と一致しておりました。 これはAの発現量が最も多いと考えるのがよいのでしょうか？（PCRではA,B,C間にあまり差がなかったのですが）。

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