全4件 ( 1 〜 4 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.851-4 - 2008/04/04 (金) 13:52:32 - N 回答いただきありがとうございました。うまく機能するケースも多いようですので試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.851-3 - 2008/03/20 (木) 10:40:55 - zz TRexは、FlpInとの組み合わせで安定に機能すると感じます。 しかし、FRT導入株の作成は困難だと感じており、市販のものを使っています。 TRexでのbackgroundの発現量は、Tet-repressorの発現程度に大きく依存します。 TetR発現株作成で、適切なクローンの取得が必須です。 rodentでCMVプロモータが機能しない可能性がTRexの取説に書いてありますが、重要性のほどは理解していません。 同じく、取説で言及されている血清中にコンタミするかもしれないTetracyclineが問題であった経験はありません。 大まかに500から1000倍程度の発現誘導がwesternで確認できます。

(無題) 削除/引用 No.851-2 - 2008/03/20 (木) 10:03:42 - ats インビトロジェンのTet誘導系(TRex)は、CMVプロモーターのTATA-box近辺にtetオペレーターをいれて、tetオペレーター結合タンパク（tetリプレッサー）で発現抑制をかけています。 したがって、CMVプロモーターが強く働かない細胞では、誘導が弱い可能性もあります。 私は、レンチウイルスを使い神経芽腫のSH-SY5Y細胞にタグ付きタンパクとして導入し、クローン化せずに使用しています。ただし、tetリプレッサー発現レンチウイルスベクターはIRESを利用し改変しています。 具体的には、western blotで大量にサンプルをロードすると非誘導でもバンドが観察されます。 研究対象の内在タンパクが元々少ないので、非誘導でも同量くらいの発現になってしまいます。もっともtetracycline検査された血清を使用したり、細胞をクローン化すれば良いのかもしれません。 発現誘導に関して、western blotのバンドはカタログ通りの写真が得られましたが、定量してみると20-50倍ほどでした（バックグランドの取り方でかなり変動しますので、最小値と思ってください）。

テトラサイクリン誘導系細胞株の樹立 削除/引用 No.851-1 - 2008/03/19 (水) 18:13:12 - N ヒト血球系細胞株で誘導系細胞株を樹立したいと考えています。以前にTet-off-systemで安定発現にチャレンジしたことがあるのですが、発現がリーキーなものがほとんどで良い細胞がとれませんでした。最近になってクロンテックのレトロウイルスを用いたTet-off(あるいはTet-on)advanced系と、インビトロジェンのレンチウイルスを用いたTet誘導系が新たに発売されていることがわかりました。どちらを使用したらよいでしょうか？使用した経験や注意点などがあればぜひ教えてください。

全4件 ( 1 〜 4 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---