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(無題) 削除/引用 No.85-8 - 2007/08/24 (金) 13:01:17 - ~ >モノマーのDNAはエタ沈では落ちにくいのでしょうか？ RI標識した後に、実標識のdCTPをエタ沈で除くプロトコルがあるので、 落ちにくいか、もしくは落ちない条件はあるかと思います。 シーケンス前にフリーのプライマーもエタ沈で除くプロトコルもあります。 (塩が違いますけど) >あと電気泳動についてですが、ソニケーション後は約10塩基前後になると書いてあり、 Gibcoから、10bpラダーが販売されていますので、 見ることは出来るのではないでしょうか？ http://www.invitrogen.co.jp/catalogue/invitrogen/10821-015_001.shtml そのような短いDNAになるまでソニケーションをしたことがありませんが、 ソニケーション後のDNAの長さはまちまちですよね。 泳動して平均鎖長を見ないで実験を行うのは不安ではありませんか？

(無題) 削除/引用 No.85-7 - 2007/08/24 (金) 12:26:02 - eee 残存するタンパクです。 フェノクロ等で十分にタンパクが駆除されないときに出てきます。 フェノクロの回数を増やすことで改善できます。

(無題) 削除/引用 No.85-6 - 2007/08/24 (金) 10:46:22 - linger ＞aさん 回答有り難うございます。 >>ソニケーションによる切断の具合はどうですか？ 一度最後まで精製を行ってから泳動した時は検出できなかったので、泳動で確認するのはあきらめていました。 次行う時はステップ毎に逐一泳動して確認してみたいと思います。 >>エタ沈の時は塩が存在していますか？あと、非常に短い断片なので、エタ沈中、-80℃で冷やすとエタ沈効率があがると思いますが。 塩はfinalが0.1Mになるように酢酸カリウムを加え、-80℃でO/Nで冷やしているので大丈夫だと思われます。 もう１つ質問してもよろしいでしょうか？精製の際に１つ気になっているのですが、エタ沈の時に白くて大きいペレットが見えたのでてっきりDNAがしっかり精製できていると思っていたのですが、実際は濃度測定しても泳動してもDNAが確認できませんでした。 このペレットは何でしょうか？何か精製方法自体に問題があるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.85-5 - 2007/08/23 (木) 18:56:03 - a 書き忘れました エタ沈の時は塩が存在していますか？あと、非常に短い断片なので、エタ沈中、-80℃で冷やすとエタ沈効率があがると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.85-4 - 2007/08/23 (木) 18:49:06 - a ソニケーションによる切断の具合はどうですか？ 各ステップで電気泳動をして確かめた方が良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.85-3 - 2007/08/23 (木) 13:31:54 - linger ＞~さん 回答有り難うございます。 熱変性を行う正確な理由は分かりません（おそらく一度熱変性を行った方がヌクレアーゼが効きやすくなる？）が、その後氷上で冷却しているためアニーリングして二本鎖に戻っていると思われます。 基本的な質問なのですが、モノマーというのは1塩基のDNAの事でしょうか？モノマーのDNAはエタ沈では落ちにくいのでしょうか？ あと電気泳動についてですが、ソニケーション後は約10塩基前後になると書いてあり、電気泳動では分子量が小さすぎて検出できない（泳動できない）と思い、行いませんでした。

(無題) 削除/引用 No.85-2 - 2007/08/21 (火) 20:05:30 - ~ dsDNAを回収するのに熱変性させている理由がよく分かりませんが、 そういうプロトコルなのですか？ 熱変性でssDNAになったDNAが、ssDNA用のヌクレアーゼ(MNase?)で分解されているような気がします そのために、ヌクレアーゼ処理後に、 吸光度？を測定したときにはモノマーが検出されて、 エタ沈では落ちなかったのでは まずは、各ステップで泳動してみてはいかがでしょうか

DNAの調製 削除/引用 No.85-1 - 2007/08/21 (火) 17:47:54 - linger はじめまして。実験に関しての質問があります。 今マウス血清中の抗dsDNA抗体量を測定するためELISAを行おうと思っているのですが、その準備段階のdsDNAの調製で困っています。プロトコル通りに調製を行っているのですが、回収率が非常に悪く十分量が得られない状況です。 用いているDNAはSIGMA社のDeoxyribonucleic acid from Calf thymusです。 プロトコルとしましては、ソニケーション→　熱変性　→　ヌクレアーゼ処理（ssDNAの除去）→　精製(PBSへ置換)　です。 精製方法は、フェノクロ×２回、クロロホルム×１回、エタ沈、エタリンです。 ヌクレアーゼ処理後に濃度測定を行ったところ、十分量のDNAが残っていると思われるため、精製方法に何か問題があるのでは、と考えています。 この方法に何か問題があるでしょうか？もしくは精製方法を透析などに変更した方がよろしいでしょうか？ よろしくお願いいたします。

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