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(無題) 削除/引用 No.847-6 - 2008/03/20 (木) 14:41:43 - a 私の意見も通りすがりさんと同じで、EMSA:vitro, Chip:vivoと思っています。 最近は片方のデータだけでは追加実験させられることが多いです。 ただ、Chipは上手くいかないことが多く、悩みの種です。

(無題) 削除/引用 No.847-5 - 2008/03/20 (木) 07:32:27 - 通りすがり >EMSAで、もしある転写因子との結合があったと判断した場合、その転写因子と >ＤＮＡの間に、ｃｈｉｐのように他のcofactorが介在している可能性というのは >ないのでしょうか？ おおさんのおっしゃるように大腸菌などで組み換えタンパクとして発現させ精製し単一の分子(もしくは共雑物が検出レベル以下)であることが明らかな条件でのEMSAの場合は、他のcofactorの関与の可能性は低いといえるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.847-4 - 2008/03/19 (水) 11:33:16 - おお >[Re:3] mimiさんは書きました : > 通りすがりさん＞ > ありがとうございます。 > EMSAで、もしある転写因子との結合があったと判断した場合、その転写因子とＤＮＡの間に、ｃｈｉｐのように他のcofactorが介在している可能性というのはないのでしょうか？ 横からすいません。その指摘をしとくべきと思ってましたので。 EMSAは細胞の各抽出物やライセイトをつかったばあいは、確かに直接的かどうか分かりません。直接結合しているといえる場合はリコンビナントなど、精製したタンパクで一対一で行った場合です。ラベルしたDNAをライセイトを混ぜてUVなどでクロスリンクして目的のタンパクをIPしSDSにかけるとサイズから、目的のタンパク質が直接DNAにさわっているという示唆は出来ます。 EMSAは、染色体にDNAその配列があれば、目的のタンパク質がのそこにアクセス出来るであろうと言う可能せいを示すものです。Chipはクロマチンを落としてくるわけですから、染色体のその場所に実際たんぱく質が存在していることを示しています。しかしながらそれはDNAのそのタンパクのコンセンサス配列に実際結合しているのか、クロマチンのタンパク成分とアフィニティーがあるため落ちてきたのかなど細かい点では証明ができていません。確かにDNAもそれなりに長いですから、思っていた場所によく似た配列があってそこに実際はくっついているなんて言うのもあるかも知れませんし、EMSAのように変異をいれて解析するのは手がかかり過ぎますね。

(無題) 削除/引用 No.847-3 - 2008/03/19 (水) 10:17:07 - mimi 通りすがりさん＞ ありがとうございます。 EMSAで、もしある転写因子との結合があったと判断した場合、その転写因子とＤＮＡの間に、ｃｈｉｐのように他のcofactorが介在している可能性というのはないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.847-2 - 2008/03/19 (水) 09:55:32 - 通りすがり EMSAは細胞から抽出した分子や組み換えタンパクおよび裸のDNAを用いた in vitroかそれに近いと考えられるの実験系です。 DNAは実際の細胞内では裸の状態では存在せず、またEMSAで用いられるような比較的短い長さのDNAではおきにくいような高次構造を実際にはとっている可能性もありますし、さらに抽出した分子や組み換えによって作った分子の性質がvivoと同等のものや翻訳後修飾などを適切に受けているかどうかなどを考慮していない状態での結合を見てしまう危険性があります。 しかしvitroの利点として、精製したものであれば目的の分子とDNAの結合をdirectに証明でき、またDNAに変異などを入れれば結合に重要な塩基などを 特定できる優れたところもあります。 一方ChIPは細胞内でのクロマチン内部に存在するDNAへの結合を抗体による免疫沈降により検出するものでEMSAの欠点である、 In vivoに近い現象を捉えてると考えられます。 しかし実験系の特徴として架橋反応により目的の分子とクロマチンを固定するためartifactを生み出す危険性があり、またEMSAと異なりその分子でなく間に未知の因子を介したindirectな結合であることを否定できない欠点があります。またあくまで数百bpの間の領域に結合することを示すのみでEMSAのような数塩基への結合を示すことは不可能です。 ようするに それぞれに長所や短所があり互いを補い合う系と考えたほうがよいので 多くの論文で両方をやって互いに欠点をカバーしあってるというわけです。

EMSAとCHIPの違い 削除/引用 No.847-1 - 2008/03/19 (水) 09:38:50 - mimi お世話になります。 我々は転写因子の結合をみるのにCHIPを始めたところです。 EMSAとCHIPでは原理からすると、結局同じことをやっているようにみえるのですが、論文では両方が出ている論文が多いように思えます。 非常に初心者の質問で申し訳ないのですが、ChipとEMSAの違いは何なのでしょうか？

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