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real time PCRがうまくかからなくなった！ トピック削除
No.843-TOPIC - 2008/03/18 (火) 19:59:44 - mae
ある遺伝子のreal time RT PCRをTAKARAのSYBRgreenを用いて、Rocheライトｻｲｸﾗｰで行っています。
ほんの4ヶ月前はうまくかかっていました（Melting peakも一定で増幅産物も目的のサイズでした）

最近久々にこの遺伝子をPCRしたところ、今までのようなきれいなMelting peakを示さなくなりました。（たくさんのpeakが出てしまいます。）

変わったことといえば、SYBR greenがnewbersionのSYBR greenUになってくらいです。
primerを-20℃で4ヶ月間放置していたのがいけないかとも思いましたが、そんなことはないような・・・

急に予期しないことが起きてしまい途方にくれています。
どなたか何かご教示ください。
　
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(無題) 削除/引用
No.843-4 - 2008/03/19 (水) 00:25:57 - MY
タカラの試薬は、化学修飾ではなく、古いタイプの抗体でTaqの活性を抑えるので、分注の時にしっかり冷やして作業しないと非特異が出るというのを聞いたことがあります。ホットスタートの時間が短いのが抗体が外れやすい証拠です。

(無題) 削除/引用
No.843-3 - 2008/03/18 (火) 21:03:37 - 7878
原因は色々考えられますが，とりあえず試薬は変えずにPrimerを新調するか，cDNAを再合成したサンプルを入れてチェックしてみては。
プライマーも水に溶解・希釈して保存だとあまり長持ちしませんし。cDNAもFreeze-thawを頻繁に繰り返すとあまりよくないかもです。

(無題) 削除/引用
No.843-2 - 2008/03/18 (火) 20:41:39 - a
何度かfreeze-thawしたcDNAを使うと同じようなことになるらしいですが・・・

real time PCRがうまくかからなくなった！ 削除/引用
No.843-1 - 2008/03/18 (火) 19:59:44 - mae
ある遺伝子のreal time RT PCRをTAKARAのSYBRgreenを用いて、Rocheライトｻｲｸﾗｰで行っています。
ほんの4ヶ月前はうまくかかっていました（Melting peakも一定で増幅産物も目的のサイズでした）

最近久々にこの遺伝子をPCRしたところ、今までのようなきれいなMelting peakを示さなくなりました。（たくさんのpeakが出てしまいます。）

変わったことといえば、SYBR greenがnewbersionのSYBR greenUになってくらいです。
primerを-20℃で4ヶ月間放置していたのがいけないかとも思いましたが、そんなことはないような・・・

急に予期しないことが起きてしまい途方にくれています。
どなたか何かご教示ください。
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