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PCR産物の長さによりますが 削除/引用 No.841-10 - 2008/03/20 (木) 19:34:15 - shiraga 十分検出可能です。 PCR産物が短ければ短いほど欠失の有無による差は検出しやすくなりましが、極端に短いDNA断片を検出しようとすると高濃度のゲルが必要になり、ゲル調製が面倒になります。 600 bp〜1 kb程度なら1%アガロースで簡単に識別出来ます。

(無題) 削除/引用 No.841-9 - 2008/03/19 (水) 14:18:10 - あが 皆さんありがとうございました。 いろいろな方法があって、大変参考になりました。 先ずは高濃度のアガロースでやってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.841-8 - 2008/03/19 (水) 01:27:50 - おお >アガロース電気泳動で９０塩基の違いは明確に再現性よく識別可能でしょうか？ 可能です。 PCR産物がその欠失をはさんで200から500ぐらいで設定すればいいと思います。アガロースは2ー3%で流せば十分違いが見れると思います。マーカーに100bpラダーがあるのはご存じですよね。ということは100bpの違いは十分認識できるはずです。それでも条件がピンと来ないなら各社カタログで100bpラダーの流したイメージとか条件を確認されればいいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.841-7 - 2008/03/19 (水) 00:51:44 - meru ロウメルティングアガロースもかなり分離度が高いです！

(無題) 削除/引用 No.841-6 - 2008/03/19 (水) 00:46:51 - Thats PCRで増幅するプライマー（センスとアンチセンス）セットと90bp抜ける部分にプライマーを設計して、３つのプライマー存在下でPCRすればヘテロも判別できますね。そうなるとやっぱりPAGEかなぁ。

(無題) 削除/引用 No.841-5 - 2008/03/19 (水) 00:43:04 - GSPs ~ さんが最後の方で言及されているようにMAMA-PCRとかありますね。でもヘテロの判別にははこれでは難があると思います（間違っていたらどなたか訂正をお願いします）。 PAGEが嫌なら試しにアガロースでやってみる（短いPCR産物ならばTBE系でいけると思います）、うまくいけばそれで良し、満足いかないなら諦めてPAGEでやる、これで良いのでは？！ ＞PAGEはゲルを作るのにかなりステップが多いので避けたいです。 短いPCR産物ならばミニゲルで十分ですので、混ぜてゲル板に流し込むだけですよ。お金があるなら買うこともできますが。

(無題) 削除/引用 No.841-4 - 2008/03/18 (火) 20:00:21 - ~ PAGEが手間がかかる操作に分類されているんですね。 どんな操作だったら出来るのでしょうか？ うまく産物が短くなるようにプライマーを設計できなければ、 欠失部分の真上でなくても、周辺の制限酵素で切ることによって 1000bpと1090bpを、300,700bpと390,700bpなどにすることによって、違いを見やすくすることは出来ます。 あと、あまり産物を短くしすぎると、両断片の増幅効率が違いすぎて見にくくなるかもしれませんので、その点についても条件検討が必要になると思います。 または、片側のプライマーについて、１つは欠失部位中にプライマーを設計し、もう１つは欠失することによって生じる配列にすることで、 どちらかのみからしか増えないという条件を作ることができるはずです。

アガロースで十分です 削除/引用 No.841-3 - 2008/03/18 (火) 18:51:49 - Eire PCR 産物がよほど長くない限り、アガロースゲルで十分だと思います。 産物の長さが 1k bp 位までなら、頻繁に使われる1%ゲルでも90 bpの差なら確認できます。 論文などに載せたいというのであれば、1.5-2%のゲルを使えばよりはっきりと分離できると思います。安いアガロースだと、濃度を上げると透明度が下がってバンドが見えにくくなることもありますが、その場合は NuSieve agarose のような短鎖 DNA の分離用に開発されたアガロースと使えばよいでしょう。 それでは、お役に立てば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.841-2 - 2008/03/18 (火) 18:48:26 - rik 聞くよりご自身で実際に泳動したほうが早いと思いますよ。 PCR産物においてこの差を区別したいというだけならば、増幅産物の長さにもよりますが2-4%でアガロースでも充分できます。90塩基と言っても90bpと180bpの場合は倍違いますからね。ただ、5,000bpと5,090bpだったりしたらほとんど誤差範囲なので、適当に短い産物を得られるプライマーを設計すれば問題ないと思います。

90塩基の違いを識別する方法 削除/引用 No.841-1 - 2008/03/18 (火) 18:05:58 - あが ある突然変異体を解析すると、当該遺伝子に90塩基の欠失突然変異があることがわかりました。 この欠失を含む領域をPCRしてして、 100個体ほどの集団を、突然変異ホモと突然変異ヘテロと野生型の個体に区別したいのですが、アガロース電気泳動で９０塩基の違いは明確に再現性よく識別可能でしょうか？ もし、アガロース電気泳動以外でも、良い方法があれば教えてください。 PAGEはゲルを作るのにかなりステップが多いので避けたいです。 リアルタイムPCRはちょっと高価なので、できれば避けたいです。 また、CAPSも検討しました。一応欠失部分に制限酵素サイトが一つあるのですが、その酵素は非常に高価で、困っているところです。 手間がかかりますが、やはりPAGEが一番良いでしょうか？

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