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(無題) 削除/引用 No.840-17 - 2008/03/19 (水) 15:05:07 - RT-PCR初心者 ご丁寧なアドバイスありがとうございます。 アニーリング温度を上げる・・・通常のPCRと同じ概念で条件を詰めていけばよいということですね。今回いろいろと有用な情報をいただきましたので、 ひとつひとつ試してみて、条件を最適化してみたいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.840-16 - 2008/03/19 (水) 13:55:48 - おお >[Re:10] RT-PCR初心者さんは書きました : > RT反応の後は、RNase処理はしておりません。可能であれば代表的な処理法をご教示いただければ幸いです。 RTの後にRNaseHを加え37度でインキュベーションするだけです。 各社カタログのRNaseHやRTの酵素のQandAなどを調べればどんなものか、なぜRTのあと行うといいかなど分かると思います。必須ではないですが、有用なことがあります。 > それから、RT反応ですが、Forwardのみで反応しても良いのでしょうか？ 他の方が指摘してますようにRTにはリバーズが必要で、フォアードは必要な反応に全く関係ありません。 PCRの条件だけで解決するような気もしてます。手元にランダムプライマーで作ったcDNAがあるようでしたら、高いアニーリング温度とかでやってみてもいいのではないかとも思いますが、、、

(無題) 削除/引用 No.840-15 - 2008/03/19 (水) 12:43:53 - RT-PCR初心者 有用な情報ありがとうございました。 早速試してみます。

(無題) 削除/引用 No.840-14 - 2008/03/19 (水) 00:32:57 - MY 通常、逆転写の正確性について議論されませんが、100kbに2bのエラー率で通常の逆転写酵素よりはるかに正確性の高い10分で逆転写が終了する酵素が出たようです。 http://app.roche-biochem.jp/catalog/index.php/product_3.6.8.39.1.3.html

(無題) 削除/引用 No.840-13 - 2008/03/18 (火) 17:08:07 - RT-PCR初心者 有用なアドバイスいろいろとありがとうございます。 Reverse primerしか成り立たない理由が理解できました。 ＞RNA抽出後はDNase処理などしていますか？ また、Total RNA溶液中にDNAのコンタミは確認されていますか？ また純度は ご質問につきましては、DNase処理は行っていますし純度はNano-Dropで必要に応じて確認しております。必要に応じて・・・ではなく今後は常にやらねばいけませんね。 Primerの設計については、TaqMan Probeのカスタムメイドをアプライド社にお願いする際に、候補の配列を複数検索していただきつつ、個々に特異性を確認しております。 皆様のアドバイスをもとにこれからまた戦略を考えてみたいと思います。上手くいかなかった場合には、また投稿させていただきます。皆様、ありがとうございました。今日は本当に勉強になりました・・・。

(無題) 削除/引用 No.840-12 - 2008/03/18 (火) 16:27:45 - PPP ワキからすみませんが、 RNA抽出後はDNase処理などしていますか？ また、Total RNA溶液中にDNAのコンタミは確認されていますか？ また純度は？ また、RT-PCRに用いるPrimerのデザインを再検討するのはどうでしょうか？ もしかすると、逆転反応を検討するより近道かも知れません。 参考までに

(無題) 削除/引用 No.840-11 - 2008/03/18 (火) 16:13:00 - ぽど mRNAと相補的に結合する必用があります． となれば分かりますよね，この場合利用できるのはリバース側のみです．

(無題) 削除/引用 No.840-10 - 2008/03/18 (火) 15:52:22 - RT-PCR初心者 アドバイスありがとうございます。大変参考になります。 RT反応の後は、RNase処理はしておりません。可能であれば代表的な処理法をご教示いただければ幸いです。 それから、RT反応ですが、Forwardのみで反応しても良いのでしょうか？ 初心者なもので大変申し訳ございません。ご教示いただきたく。

(無題) 削除/引用 No.840-9 - 2008/03/18 (火) 15:29:13 - おお "Reverseだけで反応させたほうがよい"と言うのはForawardはRTに必要ないからだと思います。必要ない物をいれて、何か邪魔になることがある可能性が全くないとはいえませんから。たとえばForawardが全く関係の無いところにアニーリングし(多分幾らかのミスマッチがある状態で)そこから伸びたcDNAはすでにForawardの配列を持っているわけですから、PCRの時ノンスペを拾う可能せいを上げるかもしれません。 >キャピラリー電気泳動装置にて増幅産物の確認をしております。以下にも書きましたように、ゲノムDNAを鋳型にした場合は、特異性に問題は無いようです。 この記述からすると、cDNAではPCRがかかってないと言う事でしょうか。 だとするとほかの可能せいも考えた方がいいかもしれませんよ。 RTのあとにRNaseHとかの処理はお使いのキットにはついているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.840-8 - 2008/03/18 (火) 14:57:30 - RT-PCR初心者 ご返信ありがとうございます。 特異性に疑問があるときには、随時、キャピラリー電気泳動装置にて増幅産物の確認をしております。以下にも書きましたように、ゲノムDNAを鋳型にした場合は、特異性に問題は無いようです。 それから、下記のRT反応時のことなのですが、ForawardとReverse両方を入れて反応してしまった良いのでしょうか？ Reverseだけで反応させたほうがよいのでは？とおっしゃる方もいますが・・・。大変申し訳ございませんが、教えていただきたく。

(無題) 削除/引用 No.840-7 - 2008/03/18 (火) 14:45:30 - おお >[Re:6] RT-PCR初心者さんは書きました : > でも、特異的なRT反応の場合、ランダムプライマー法よりも増幅が悪いということも聞いたことがあるのですが、一般的にそうなのでしょうか？ そんな事はないと思います。ただしスペシフィックなプライマーを使うと、そのプライマーの配列がRTに不向きだったりと言う事もあり得るので、プライマーに依存するのではないでしょうか。 あと、ランダムプライマーの濃度をいじる手もあるかもしれないとふと思いました。 PCRして、電気えいどうで実際にバンドは確かめてますでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.840-6 - 2008/03/18 (火) 13:51:49 - RT-PCR初心者 大変ありがとうございました。 いま、手元にあるキットの中身を再度確認してみて、おっしゃっていることが良く理解できました。早速試してみます。 でも、特異的なRT反応の場合、ランダムプライマー法よりも増幅が悪いということも聞いたことがあるのですが、一般的にそうなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.840-5 - 2008/03/18 (火) 13:39:00 - おお 追加します。バイオラッドやプロメガなど各社RT試薬を出しています。キットを買うとして、その中のコンポーネントにランダムプライマーとか明記があるものを使えばいいかと思います。ランダムプライマー代わりにスペシフィックを使えばいいわけですから。

(無題) 削除/引用 No.840-4 - 2008/03/18 (火) 13:32:27 - おお RTもキットを買えば出来るので、その中身を気にしない人が増えてきたんでしょうか、、、 ランダムヘキサマーとかの代わりにスペシフィックなものを使えば良いだけで、あとは一緒です。 キットではないですが、インビトロジェンのスーパースクリプトIIorIIIのプロダクトマニュアルを読めば濃度などの具体的なサジェスチョンがあります。

(無題) 削除/引用 No.840-3 - 2008/03/18 (火) 13:30:04 - RT-PCR初心者 早速のアドバイスありがとうございます。 お恥ずかしながら、アプライドのHigh-Capacity RT キットしか使用したことがなく、RTのベースの反応液組成が不明なのです。ご教示いただきたくよろしくお願いします。 また、プライマーの再検討は進めております。Tmについては文献記載のものだけでなく、アプライド側で２つのプライマーのTmが適切になるようにモディファイしたものも試しております。

(無題) 削除/引用 No.840-2 - 2008/03/18 (火) 13:14:06 - ぽど 知人さんは、ランダムプライマーの代わりに，目的配列に特異的なオリゴを用いて逆転写反応しては？と言っているのでしょう。 プライマーを発注するだけです。特にキットなどありません。 ちなみに私でしたら逆転写反応をモディファイする前にプライマーやTmの再検討を致しますが、すでにProbeを購入した後なので少なくともプライマーの変更はは避けたいという状況なのかもしれませんね。それでもTmくらいは再検討してみても良いのではないでしょうか？

特異的なRT反応のためのお奨めのキットは？ 削除/引用 No.840-1 - 2008/03/18 (火) 12:20:19 - RT-PCR初心者 とあるバクテリアの特異的な検出を目的として、RT-PCRの検討を進めています。 RT反応はランダムプライマー法で、TaqMan Probeを使用してRT-PCRを行っています。しかし、文献にあるような特異性が出ない。ゲノムDNAを用いた特異性の確認ではOKでしたが、RNAからランダムプライマー法によるRT反応をかけた ｃDNAでは特異性が低くなるので、RT反応時に何か副産物が生じているように思います。とりあえずランダムプライマー法ではなく、目的配列に特異的なRT反応をするのが良いのでは？と知人にアドバイスを受けたものの、適切なキットについてはアドバイスいただけませんでした。 適切なキット、あるいは参考文献をご存知の方、どうぞアドバイスいただきたく、よろしくお願いします。

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