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(無題) 削除/引用 No.836-8 - 2008/03/18 (火) 12:17:51 - FLAG >おおさん メソッドまで拾っていただきありがとうございます。 少量しか取れないならスケールアップも視野に入れて実験を進めて行きたいと思います。 お忙しい中、数々の貴重なご意見ありがとう御座いました。

(無題) 削除/引用 No.836-6 - 2008/03/18 (火) 12:06:39 - おお >[Re:5] FLAGさんは書きました : > この際はTCA/アセトン抽出などを行えばいいですかね。 無責任な言い方ですがこの際何でもいいかと思います。ただしアセトンは知り合いが、細胞直接か、ライセートから回収しインビトロジェンの2次元にかけようとしたけどうまく行かなかったと言うのがありました(2D DIGEとかで使ってたりするのを見たことあるのですが、、、)。TCAでそのあと冷えた95%エタノールでよく洗うか、ですね。昔サンプルをお願いしたマス解析のラボは2D何かで解析する際クロロフォルムとメタノールを使う方法を勧めていました。メソッドをウェブからひろっておきました。 (ちょっとほかの方法より手がこんでます。何種類も同時にするにはめんどくさい方法です) http://www.healthsystem.virginia.edu/internet/biomolec/methanolchloroform.cfm http://abrf.org/ResearchGroups/EdmanSequencing/EPosters/ABRFhand1.doc この手の方法はタンパクに対して若干相性的なものがあるのと、濃度が薄いと大丈夫かなぁというのがありますが、濃度的には抗体をそこそこの量入れているわけですからボリュームさへ大きくなり過ぎなければ(1.5mlチュウブで処理するぐらい)何とかなるかなと思います。 > > CHAPsと還元剤を入れたバッファーでの溶出を考えてみたいと思います。 > これは書こうと思ってたのですが、、、忘れてましたね。

(無題) 削除/引用 No.836-5 - 2008/03/18 (火) 11:03:50 - FLAG >おおさん ありがとうございます。なるほど。確かに一度溶出させておいて、タンパク質だけを抽出できれば良いですね。 この際はTCA/アセトン抽出などを行えばいいですかね。 ウレアは熱をかけられないので困難なのですが、CHAPsと還元剤を入れたバッファーでの溶出を考えてみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.836-4 - 2008/03/18 (火) 00:14:05 - おお >つまり、目的タンパク質が非特異的に支持体であるアガロースビーズに結合しているということでしょうか？ そうですね。でもSDSで溶出できるなら何とかなるかもしれません。 尿素だけとか1%程度のCHAPSだけでは溶出できませんか?あとシグマからM5というflagの抗体が出てます。抗体の抗原認識にカルシウムが必要なので、カルシウム存在下でIPしキレーターで溶出できます。 あとはSDSで溶出しておいてメタノール/クロロフォルムかアセトンなどでタンパクを回収するとかも考えられます。

(無題) 削除/引用 No.836-3 - 2008/03/17 (月) 15:59:27 - FLAG >おおさん ありがとうございます。 8 Mウレア、CHAPSでの溶出の他に、通常のSDSサンプルバッファーを加えてヒートショックし、WBでIPの効率および条件検討も行いましたのでIPの効率は問題ないと考えております。 ＞もし、IPによって十分回収できていて、ゲルからの回収率が悪いとお考えならば、支持体との相互作用と思われます。 つまり、目的タンパク質が非特異的に支持体であるアガロースビーズに結合しているということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.836-2 - 2008/03/17 (月) 15:37:53 - おお まず、ターゲットのIPの効率は疑う余地がないとお考えでしょうか。それによってやる事が変わってくると思います。抗体の結合能力はお示しの条件では失活していると思いますので、もし、IPにょって十分回収できていて、ゲルからの回収率が悪いとお考えならば、支持体との相互作用と思われます。磁気ビーズとか他の物を試す価値はあると思います。

二次元電気泳動サンプル 削除/引用 No.836-1 - 2008/03/17 (月) 14:37:54 - FLAG IP後のサンプルを二次元電気泳動にかけたいと考えております。 現在、目的タンパク質をFLAGタグのついた形で発現させ、FLAG抗体、プロテインGアガロースを用いてIPした後、8 MウレアとCHAPS（2DE）の可溶化バッファーを加えることで抗原抗体反応をはがすことを試みてみました。 しかし、この方法では目的タンパク質の回収効率が悪いことがわかりました。 FLAGペプチドを用いて溶出する方法も考えてはみたのですが、sample volumeが多くなってしまい、2DEをするのが困難です。 同様の場面に直面したことがある方、知っている方、アドバイスをいただけたら幸いです。 よろしくお願いします。

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