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ありがとうございました 削除/引用 No.833-8 - 2008/03/22 (土) 11:33:48 - うえすたん みなさま、ご回答ありがとうございました。 お返事が遅くなって申し訳ございません。 皆様の意見を参考にいたしまして、 まずRT-PCRにて確認後、 無血清培地でのwestern blottingでprotein levelの確認をする予定です。 その後、結果に応じて、FACSまたはIFにて確認を考えています。 本当に参考になりました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.833-7 - 2008/03/17 (月) 11:25:07 - おお >FCSにも含まれていますので、無血清培地での培養での検討も行なう予定です。 たしかにそうした方がよさそうですね。牛のそのタンパクの配列や大きさなどは調べましたか?抗体でクロスリアクトしないものがないかどうかとか、そういうものを作るのも視野に入ってきますね。その細胞が発現する直接的な根拠はmRNAを見ることです。in situハイブリダイゼーションだと直接的ですね。ただし、定量的な解析は難しいと思いますけど。FCS刺激で発現が上がるとすれば、プロモーター解析も根拠になるかもしれません。 ただし、ポストトランスクリプショナルな制御も可能性がありますので、頭の片隅にそれをインプットしておくといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.833-6 - 2008/03/17 (月) 09:49:42 - ポストポスドク うえすたんさん mRNAレベルの確認ができたら一歩前進だとは思いますが，細胞分取-PCRの流れでは常に他の細胞のコンタミを疑う必要がありますから，その他の実験も加えて多角的に証明するほうが望ましいとは思います． （もちろんmRNA確認でOKとされる場合も多いでしょうが，今回のように発現報告がない場合には第三者を納得させるためにも慎重に行きたいところです） うえすたんさんの予定されている無血清培地での実験や，各種顕微鏡やフローサイトメトリーで単細胞レベルで当該細胞にて発現されていることの確認，あるいは細胞内の局在などのデータも発現可能性を高めるうえで有効のように思います（このあたりのアプローチは専門ではないので単なる感想レベルですが）．

mRNA発現 削除/引用 No.833-4 - 2008/03/17 (月) 09:08:18 - うえすたん ポストポスドク さん ご回答ありがとうございます。 mRNA発現に関しては、まだ確認していません。 確かにmRNA発現を確認すれば、その細胞がタンパクを発現しているかどうかが確認できますね。 mRNA→proteinの流ればかり気にしていて、 下流にあるタンパクが確認できたら発現しているかも？と 早とちりをしてしまっていました。 定量的PCRなどでの確認を行ないたいと思います。 ちなみに、mRNAでの発現が認められた場合には、発現しているという結論を出してもいいのでしょうか？それとも、その他の実験系での証明も必要なのでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.833-3 - 2008/03/17 (月) 06:28:21 - ポストポスドク mRNAの発現は確認されました？ 以前に似たような状況（対象が分泌タンパクで，当該細胞での発現報告がほとんどない）で同じような結果を得た事がありました． Highly purified cellを用いてのQ-PCR解析ではまったくmRNA発現が認められなかったことに加え，対象タンパクのレセプター欠損マウスを用いると細胞内の対象タンパクが消失したため，レセプターによる細胞内取り込みを見てたのだろうと解釈したことがありました． 今回のうえすたんさんの結果を否定するものではありませんが，そういうこともあったということをお知らせしておきます．

血球系細胞でのタンパク発現 削除/引用 No.833-1 - 2008/03/17 (月) 02:44:06 - うえすたん 今回は質問があって書き込みをしています。 現在、血球系細胞のタンパク発現を検討していますが、 そのターゲットは、通常血清中に存在し、現在使用している血球系細胞でのタンパク発現は、自分が調べる限りでは報告されていません。 ただ末梢血から分離直後の細胞でもウエスタンブロッティングでの発現が確認でき、FCS存在下での培養後には、その発現が更に増強しています。 サンプルは、PBSにてwashした後に回収しています。 このような場合には、「この血球系細胞にターゲットタンパクが発現しており、培養により更に増強する」と言うことはできるのでしょうか？ このタンパクは、細胞膜にアンカーすることは別の細胞では報告されていますので、血清中のタンパクが血球系細胞に結合して、タンパク発現（結合）が確認できたのでしょうか? もちろん、FCSにも含まれていますので、無血清培地での培養での検討も行なう予定です。 分かりにくい文章で申し訳ございませんが、もしよろしければ、皆さんのご意見を聞かせてください。

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