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RNaseHはメーカーによって違うのか？ トピック削除
No.826-TOPIC - 2008/03/14 (金) 18:02:00 - ko
投稿も初めてですし，分子生物学的な知識も乏しいので，変な質問でしたらご指摘ください。

私の研究室では，動物組織より抽出したRNA（total）をインビトロジェンのSuperScriptIIファーストストランドシステム（random hexamer）を使ってcDNA合成し，RT-PCRを行っています。このキットのマニュアルでは，最後に，RNaseHを使って余分なRNA鎖を切断するように推奨されています。

キットのRNaseHがなくなったので，買い足そうと思ったところインビトロジェンだと30Uで7,300円でした。こりゃ高いと思い，他のメーカーを見てみると，タカラは1000Uで15,000円。１５倍以上の価格差です。私の研究室はお金がないので安いものを使いたいのですが，あまりの価格差に踏ん切りがつきません。

どなたか，使い分けたことがありますか？また根本的に，RNaseHは必要なのでしょうか？

先輩方のご助言を頂ければと思い，投稿させていただました。よろしくお願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.826-6 - 2008/03/19 (水) 00:48:01 - MY
RNaseH活性のある逆転写酵素もありますよ。

(無題) 削除/引用
No.826-5 - 2008/03/16 (日) 00:47:17 - おお
タカラでも大丈夫かなという気がします。１度商品の詳細をよく見てみればいいかもしれません。リコンビナントかどうかとか、場合によってユニットの定義が違ったりと言う事があり得ます。

でなぜもっと具体的なアドバイズができないかと言うと、私はRTPCRの時RNaseHを使っていないからです。たいていの場合はかかるかどうかと言えばかかります。でもRNaseH処理をしないとかからなかったというターゲットも経験しています。
PCRがかかればいいというレベルではRNaseHなしでやってみて、うまく行かなかったものに関してはRNaseHを使ってみるというのもありかもしれません。
でもリアルタイムPCRや、分析的な実験であれば、条件の違いによりさが出ますので、この辺の条件は揃えてなければ違う結果が出てしまう可能性も考慮に入れるべきと思います。

ありがとうございます 削除/引用
No.826-4 - 2008/03/15 (土) 22:42:57 - ko
Pumpkin さん、Eireさん

ご助言ありがとうございました。
1kbを超える場合で、RNaseHなしの場合と大きく違う場合は、使う必要があるけど、なくとも大丈夫だろうとの、ご意見と理解しました。

やはり、私の条件でRNaseHなしでやってみて、よければそれで行きます。だめだった場合は、またご相談したいと思います。

皆さんの、レスポンスの速さにありがたい限りです。どうも、ありがとうございました。

RNaseH なしでも大丈夫では？ 削除/引用
No.826-3 - 2008/03/15 (土) 19:31:53 - Eire
> また根本的に，RNaseHは必要なのでしょうか？

私は RNaseH は加えていません。

1st strand system は使ったことはありませんが、 SuperScript II は RT-PCR で cDNA をクローニングするときによく用いています。SuperScript II の説明書によると、1kb を越えるターゲットを増幅するときは増幅に RNaseH 処理を必要とする場合もある、ということなので、常に加える必要はないのではないでしょうか。

ちなみに私の場合 SuperScript II と オリゴ dT プライマーで作製した 1st strand cDNA を RNaseH 未処理で鋳型に用い、 Phusion DNA polymerase (Finnzyme; 販売は NEB) を用いて PCR していますが、これまでのところ最長で 2.5kb の cDNA を問題なく増幅できています。

では、お役に立てば幸いです。

(無題) 削除/引用
No.826-2 - 2008/03/15 (土) 19:03:21 - Pumpkin
確かにInvitrogenのRNaseHは高いかもしれません。RNA-DNAハイブリッド鎖はDNA二本鎖よりも結合が強固だといわれているので、PCR最初のdenatureの条件をきつくすればクリアできる問題かもしれません。

また、TaKaRaのキットの場合RNaseHの使用はオプショナルになっていることがほとんどです。PrimeScript® 1st strand cDNA Synthesis Kitの技術情報を見てみてください。

僕ならば、RNaseHなしでPCR反応の条件を振ってみます。それでも以前とちがうようなら(non-speが多いとか増幅しないとか）RNaseHを買いますが、やはりコストパフォーマンスの良い方を買いますね。

RNaseHはメーカーによって違うのか？ 削除/引用
No.826-1 - 2008/03/14 (金) 18:02:00 - ko
投稿も初めてですし，分子生物学的な知識も乏しいので，変な質問でしたらご指摘ください。

私の研究室では，動物組織より抽出したRNA（total）をインビトロジェンのSuperScriptIIファーストストランドシステム（random hexamer）を使ってcDNA合成し，RT-PCRを行っています。このキットのマニュアルでは，最後に，RNaseHを使って余分なRNA鎖を切断するように推奨されています。

キットのRNaseHがなくなったので，買い足そうと思ったところインビトロジェンだと30Uで7,300円でした。こりゃ高いと思い，他のメーカーを見てみると，タカラは1000Uで15,000円。１５倍以上の価格差です。私の研究室はお金がないので安いものを使いたいのですが，あまりの価格差に踏ん切りがつきません。

どなたか，使い分けたことがありますか？また根本的に，RNaseHは必要なのでしょうか？

先輩方のご助言を頂ければと思い，投稿させていただました。よろしくお願いします。
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