全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.822-10 - 2008/03/16 (日) 10:11:51 - おお もう一つは合理性かもしれませんね。RNAとDNAでつかえる酸性の酢酸ナトリウムを作って、わざわざ中性の物をつくる必要性を感じないというのはあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.822-9 - 2008/03/16 (日) 01:36:01 - おお 私の知識の範囲で考えれることをまとめておきます。 RNAは酸性側のほうが安定です。たぶんDNAはアルカリ側の方が安定なのでしょうが、酢酸や弱酸性でそんなに困ることは起きていません。ノーザンブロットでは弱酸性に振ったMOPSのバッファーで電気えいどうをしますが、これはノーザンの条件では酸性側のほうが安定だからです。一方DNAは一本鎖のDNAを電気えいどうのため、NaOHを使うことがあります。さらにRTのあとにNaOHを使って、RNAを分解するというプロトコールも存在します。DNAはアルカリ側で可也タフです。そう言えば大腸菌からのプラスミド精製の時もNaOHを使いますね。 一方サザンブロットで非常に長いDNAをトランスファーしなければならない時はHCl溶液にゲルを漬けて部分的に分解する方法があります。この条件でRNAが安定かどうかは分かりません。 一方尿素存在下でPAGEでRNAを電気えいどうする時はTBEを使います。この程度のアルカリではそんなに問題はないようです。RNAをTEで溶かすこともありますし。 でエタチンですが、酸性の酢酸ナトリウムをDNAにも使ってますし、特にRNA用という事はないと思います。酸性側のほうが、核酸の電荷は減ると思いますので沈殿には有利に働くだろうと言うのは間違っていないと思います。でもどの程度かと言われると分かりません。中性のたの条件でも可也効率がいいからです。確かに、ポリアクリルアミドゲルから32Pのシグナルで検出されるようなバンドを切り出すとか言うのであれば非常に微量の可能性もあり、酸性側に振ったほうが言い様にも思えます。 中性の酢酸ナトリウムが存在しますし、それを使うのはその他にも理由があるのではとちょっと思います。例えば酸性に振ると混在する何か同時に沈殿する可能性があるとかかなと、、

(無題) 削除/引用 No.822-8 - 2008/03/15 (土) 15:26:59 - ふむ ポケットマニュアルは間違いも多く、参考にしないほうがいいですよ。やはりモレクロなどの実験書を参考にすべきだと思います。

(無題) 削除/引用 No.822-7 - 2008/03/15 (土) 08:43:51 - よこから えっ！？様へ、ご指摘ありがとうございます。 ＞pH5.3は、RNA用です。DNA用はpH 7~8になります。 の情報源なんですが、 私は、何かのキットの中のマニュアル中に、pH7を使うように書かれていたのを見て、初めて知りました。 昔のことなので、どのキットかと言われると、わからないのですみません。 それ以降は、通常のEtOH沈にこのpHを使っています。 >これは、RNAが弱酸性条件下で安定であり、DNAが弱アルカリ側で安定である理由によります。 このときにpH5.2でないことに疑問を持って、ある人に聞いたら、このような回答を得て、納得していました。 これウソなんですか？ あとは信頼できる実験書とは言えませんが、羊土社の「バイオ実験法&必須データポケットマニュアル」のP46のEtOH沈の項目にはpH8のNaOAcを使うとあります。 また同様に、「バイオ実験試薬調整ポケットマニュアル」のP25には、RNA用は、pH5.2に合わせるとあります（ただしDNA用に、pH8に合わせるとの記述はありません。） ＞核酸は酸不溶性があり、核酸よりやや電離度が高い酢酸の塩で（depurinationを起こすほどではなく）酸性に寄せて、核酸の電離を抑えて沈殿しやすくするのだと、私は理解していました。 電離の関係だとすると、pH7-8を使うことは、あまり意味のないことのようですね。 曖昧な情報を書き込んだのは不注意でした。トピ主のSAさんを混乱させて、申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.822-6 - 2008/03/14 (金) 16:13:26 - 化学平衡 酢酸の電離定数を1.8×10^(-5)として計算すると [CH3COOH]:[CH3COO(-)]=1:2.84 となります。 酢酸の電離定数が非常に低いことから、 [CH3COOH]=酢酸の濃度 [CH3COO(-)]=酢酸ナトリウムの濃度 と考えられるので、酢酸ナトリウムの物質量の1/2.84 すなわち終濃度1.06M程度になるように酢酸を加えれば、pHは5.2になる計算です。

(無題) 削除/引用 No.822-5 - 2008/03/14 (金) 13:03:02 - えっ！？ ＞pH5.3は、RNA用です。DNA用はpH 7~8になります。 これは、RNAが弱酸性条件下で安定であり、DNAが弱アルカリ側で安定である理由によります。 どこでそいうことをお知りになったのでしょう、情報源を知りたいです。 NaOAc pH5.2 (あるいはその前後）は、DNA沈殿、RNA沈殿ともにずっと使われているconventionalな塩で、数々の信頼できる実験書にも、そうあるわけですが。 まあ、塩濃度さえ十分なら中性付近でも沈殿するでしょうが。 核酸は酸不溶性があり、核酸よりやや電離度が高い酢酸の塩で（depurinationを起こすほどではなく）酸性に寄せて、核酸の電離を抑えて沈殿しやすくするのだと、私は理解していました。 アルコール沈殿にはいろいろな種類の塩が使われますが、種類によっては、ダウンストリームの操作や反応に影響があるといわれています。 Cl-、Li-、NH4+によって阻害される酵素があったり、ある種の修飾、ラベルをした場合は溶けにくい塩を作るものがあるなど。そういうのに引っかからないのならあとは個人の好みでいいようです（そのなかでNaOAcが一番制限がないのは確かですが）。 ＞例えば50mlの3M溶液を調製するには、酢酸を何ml加えればＯＫだったといった経験はありませんでしょうか 実測値とはどうしてもズレが生じるでしょうが、やろうと思えばpKaから計算できるでしょう（かつてのボスからは、それくらいの計算ができなきゃ生物学、生化学の研究者じゃない、と言われましたが、正直、私はだめです）。 それと、3M NaOAcがついているキットもありますから（多くの場合使われずに余っている）、研究室にあるのを探して活用するのもいいですね。

(無題) 削除/引用 No.822-4 - 2008/03/14 (金) 00:24:55 - よこから 解決済みのようですが、 目的はcDNAの濃縮ですね？それでしたら3M NaOAcはpH5.3ではなく、pH7.5に合わせる方がいいです。 pH5.3は、RNA用です。DNA用はpH 7~8になります。 これは、RNAが弱酸性条件下で安定であり、DNAが弱アルカリ側で安定である理由によります。

ありがとうございます。 削除/引用 No.822-3 - 2008/03/13 (木) 18:58:58 - ＳＡ おおさん、早速のご返事ありがとうございます。自分も、ＮａＣｌでも良さそうとは思っていましたが、「ピコグラムオーダーでも回収できる」のであれば、エタノールだけでもいけそうな気はします。

(無題) 削除/引用 No.822-2 - 2008/03/13 (木) 18:49:21 - おお まわりのラボにpHメーターないですか?あと、エタチンぐらいであればpH試験紙でも何とかなると思います。あと最近のプロトコール集なら書いてあるものがあったような気がしますが、、モレキュラ-クローニングとか載ってなかったですかね。 あと絶対に酢酸ナトリウムでないといけないことはないと思います200mM前後のNaClでもいいと思います。エタチンは非常に効率のいい方法ですピコグラムオーダーでも回収できるみたいなので、エタチンでいいのではないでしょうか。問題は沈殿が見えないため、気がつかずにアルコールと一緒に捨ててしまうことですが、キャリアーを入れれば安心だと思います。tRNAとかグリコーゲンとか色のついたやつとかも売っているみたいですね。 あと長さが非常に短い場合(といっても20merとかですが)マグネシウムを加える場合があります。Mg++存在下のほうが効率いいからです。でもRTのバッファーにMg++は入っていますのであまり何も考えずそのままやってもいいかと思います。

３Ｍ NaOAcの調製について 削除/引用 No.822-1 - 2008/03/13 (木) 17:54:05 - ＳＡ こんにちは。RNAから合成したcDNAをエタノール沈殿で濃縮しようと思っています（いつものように水で希釈してPCRをかけたら、あまりにもテンプレート量が少なすぎたみたいなので。もともとのRNAの質も良いものではありませんでした） その際に、塩として酢酸ナトリウムを使おうと思っていますが、今の研究室では既成のsolutionはなく、3M NaOAcは自分で調製しないといけないようです。一般的には、酢酸を用いてpH5.2に合わせるようですが、この研究室にはpHを測定する機器がありません。そこで、経験上、例えば50mlの3M溶液を調製するには、酢酸を何ml加えればＯＫだったといった経験はありませんでしょうか。 　あるいは、低濃度のcDNA溶液を濃縮する別の手段があれば良いのですが。真空乾燥機もないので水分を飛ばすことも出来ず。。

全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---