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(無題) 削除/引用 No.818-12 - 2008/03/17 (月) 12:02:57 - 蛍光観察 >ねずみさん 確かに抗体の特異性と目的タンパク質の発現レベルを考慮してみることも重要ですね。 貴重なアドバイスありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.818-11 - 2008/03/17 (月) 11:32:32 - ねずみ > 使用しているのは培養細胞です。 > 私の用いている細胞は浮遊細胞と言うこともあり、遺伝子の導入効率も低く、発現効率も悪いということを以前に調べております。 > > ただ通常の細胞でも、調べているタンパク質が細胞に多く存在するということは否めないですね。 > 何か適切な観察方法とかあるでしょうか？ 恐らく、遺伝子導入されていない細胞というのもたくさん観察されていることでしょう。そういう細胞では全く染まらないというのであれば、そのこと自体が、抗体の高い特異性を意味しているということになります。もしそういう細胞でも結構染まるのでしたら、内在性にその蛋白質がかなり発現しているか、抗体の特異性が低いかのいずれかだということになります。もし、抗原ペプチドなどが手に入るのでしたら、抗原吸収してみれば、抗体の特異性に関してはある程度見当がつきます。 endogenousにもexogenousにもその蛋白が多すぎるというのであれば、そもそも遺伝子導入せずに内在性の蛋白質の局在を調べるというのは一つの手です。そもそもこの場合、野生体との区別をつけられない限り、変異体の局在などは調べられませんので、外から遺伝子導入するメリットは少ないように思います。

(無題) 削除/引用 No.818-10 - 2008/03/17 (月) 10:46:28 - 蛍光観察 >mmさん ありがとうございます。是非試してみたいと思います。 >ねずみさん 使用しているのは培養細胞です。 私の用いている細胞は浮遊細胞と言うこともあり、遺伝子の導入効率も低く、発現効率も悪いということを以前に調べております。 ただ通常の細胞でも、調べているタンパク質が細胞に多く存在するということは否めないですね。 何か適切な観察方法とかあるでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.818-9 - 2008/03/14 (金) 08:22:23 - ねずみ 確認ですが、細胞を染めていらっしゃるというのは、培養細胞ですか？ もし、発現させたタンパク質を見ていらっしゃるのでしたら、その発現が強すぎるということはないでしょうか？ その点がはっきり読めなかったので、質問させて頂きました。

(無題) 削除/引用 No.818-8 - 2008/03/14 (金) 02:52:53 - mm もう解決したかもしれませんが、自分はBSA/PBSで洗っていた時よりも0.1%Tween20/PBSに変えてからバックが下がり像も鮮明になったのでそれを薦めてました。 マニュアルなどによってはそう書いてあるものもあったので。

(無題) 削除/引用 No.818-7 - 2008/03/13 (木) 18:13:24 - 蛍光観察 >組織さん お手数おかけしてすみません。ありがとうございます！！ アドバイスに基づき抗体濃度をふって行ってみます。

(無題) 削除/引用 No.818-6 - 2008/03/13 (木) 17:37:05 - 組織 >抗体は1〜２ μg/mlくらいの濃度で用いております。 > 抗原とそれに対する抗体にもよると思いますけれども、一般的に考えて濃度は濃いでしょうか？ 今まであまり気にしたことがなかったので、今調べてみたのですが、だいたい1-2ug/mlで使っていますね。 ただ、言われる通りケースバイケースなので、実際に染めた結果から至適濃度を決めますね。みなさんそうだと思いますが。 今回の質問者さんのケースでは、洗いで劇的に結果が変わることはない気がします。 十分強いシグナルが出ているのであれば、抗体を希釈する余地があるので（勘ですが、あと50倍くらいはいけると思います）、一度試されることをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.818-5 - 2008/03/13 (木) 16:50:07 - 蛍光観察 >組織さん なるほど、確かに考えておくべき問題ですね。ありがとうございます。 ちなみに、抗体は1〜２ μg/mlくらいの濃度で用いております。 抗原とそれに対する抗体にもよると思いますけれども、一般的に考えて濃度は濃いでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.818-4 - 2008/03/13 (木) 16:32:42 - 組織 書き込みを見る限り、抗体が過剰なのかなという印象を受けますね。 シグナルが強すぎると、局在が見にくくなる事があります。 一次抗体を10倍くらい希釈したらどうでしょうか。 コントラストが良くなれば、局在がはっきりすると思います。

(無題) 削除/引用 No.818-3 - 2008/03/13 (木) 12:59:36 - 蛍光観察 共焦点を用いての観察も行ってみました。 ただ、蛍光あるいは共焦点を用いた観察でも細胞が染まり過ぎてしまっていて、二つのタンパク質の局在がほぼ重なってしまっているのです。 何かしら対策は練れないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.818-2 - 2008/03/13 (木) 12:27:40 - ~ よく染まっているのに局在がはっきりしないというのが、どういう状態か分からないのですが… バックが高いということでしょうか？ 共焦点レーザー顕微鏡を使うことは出来ませんか？

蛍光観察のノンスペについて 削除/引用 No.818-1 - 2008/03/13 (木) 11:29:28 - 蛍光観察 細胞の各タンパク質の局在を蛍光抗体法を用いて観察する試みをしています。 ある二つのタンパク質の局在を追い、共局在かを調べたいと思っています。 双方ともよく染まってくれてはいいるのですが、局在がはっきりしません。 その原因として、サンプルのWashがうまくいってないために抗体が非特異的にくっついてしまってるのではないか？と考えました。 私は、抗体処理の後にサンプルカバーガラスを35mmdishに移し、0.1% BSA/PBSで5回Washするという方法を行っているのですが、これでは甘いのでしょうか？ Washと言いましても、dishを軽く振る程度です。 もし適切な方法をご存知の方いましたら、ご教授していただけると幸いです。 よろしくお願いします。

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