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(無題) 削除/引用 No.81-7 - 2007/08/27 (月) 02:50:35 - CHY １次抗体としてmouse IgGを使っているのでしたら、mouse tissueではnon-specificシグナルが出やすくなります。Mouse on Mouse bloking キットなどを使うことで、２次抗体由来のnon-specific シグナルを減らす事が出来ます。 もしABCキットにも使われているavidinに親和性の高いタンパクが豊富に含まれている組織でしたら、「PicturePlus」や「ヒストファイン」のように、ポリマーを介して多数のHRPやAPがconjugateされている２次抗体を使う事で、ABCキット由来のnon-specificシグナルを抑える事が出来ると思います。

(無題) 削除/引用 No.81-6 - 2007/08/24 (金) 08:48:51 - さといも ねずみさん、ありがとうございます。 あれこれ試してみてダメならケミコンの抗体も 使ってみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.81-5 - 2007/08/22 (水) 00:51:36 - ねずみ Vector以外の二次抗体も試してみてはいかがでしょうか。 私はケミコンの二次抗体を使っており、二次抗体のみでも脊髄白質の細胞が少し染色されますが、普段は気になりません。 あと、ブロッキングを血清などでしっかり行うのも重要ですが、DABの発色の際の過酸化水素濃度を若干下げてはいかがでしょうか。発色時間は長くなりますが、発色がゆっくり進むので、バックグラウンドが濃くなってしまう前にspecific signalのS/N比の良いところで発色を止めることができるかもしれません。私はDABkitは使ったことがありませんが、過酸化水素濃度を操作できるのであれば一度試してみてください。

(無題) 削除/引用 No.81-4 - 2007/08/21 (火) 16:42:58 - さといも 組織さん、さっそくのアドバイスありがとうございます。 白質の部分に非特異的反応が起こりやすいというのを 読んで少しホッとしました。原因が全く分からなかった ので。 今後、ABC kitの反応時間などを少し変更してトライして みます。

(無題) 削除/引用 No.81-3 - 2007/08/21 (火) 14:18:24 - 組織 > 一次抗体無しのnegative controlでも同じ現象が起こります。 ここを見逃してました、すみません。二次抗体の非特異ということですね。 下にも書きましたが、まずはABCKitの反応条件をゆるめてみてはどうでしょうか。 もちろんシグナルが出ていることが条件ですが。

(無題) 削除/引用 No.81-2 - 2007/08/21 (火) 14:05:29 - 組織 脊髄凍結切片の免疫染色では、白質に非特異が出やすいです。 多分ミエリンかなんかに抗体が吸着してしまってるためだと思います。 私は一次抗体の前にTriton/PBSで2-3回浸透化処理をし、一次抗体をブロッキング液で希釈することで、なるべく非特異結合を抑えるようにしています。 あと、ABCkitは感度が良い一方で、非特異も出やすい気がします。 シグナルがきっちり出ているのであれば、反応液を希釈するなり、反応時間を短縮するなりすれば、バックは抑えられると思います。

マウス脊髄のc-Fos免疫染色 削除/引用 No.81-1 - 2007/08/21 (火) 12:08:37 - さといも マウスの腰部脊髄を用いてc-Fosの免疫染色をしています。4%PFAで固定し30μmの凍結切片を用いて一次抗体はSantaCruz、二次抗体はVectorのもの、あとはABCkitとDABkitを使って染めています。たまにうまく染まるときがあるのですがたいていは脊髄の白質の部分ばかりが一次抗体の希釈倍率に関係なく濃く染まり、一次抗体無しのnegative controlでも同じ現象が起こります。wash不足かと思い増やしたりしているのですが、まったく改善しません。どなたかこのような現象を経験されたことがありますか？

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