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剖検サンプル自体が発する蛍光 トピック削除
No.808-TOPIC - 2008/03/11 (火) 20:28:56 - kata
蛍光抗体を付けなくても、ホルマリン固定した剖検サンプルは蛍光を発するものでしょうか？！

現在剖検組織（脳）の切片（ホルマリン固定、パラフィン包埋）を使って二重蛍光免疫染色をしています。
二種類の一次抗体（mouse、rabbit）を用い、それぞれの二次抗体にFITC、Cy3をつけたものを使用しています。

二種類とも神経細胞の細胞質でmergeしたのですが、一次抗体をなしにしても同部位が赤い光を発するのです。二次抗体が直接ついているのかと思い一次抗体、二次抗体なしでレーザー顕微鏡で見てみたら、なんとやはり神経細胞の細胞質のみが光るのです。

調べてみたら赤・青共に光ることがわかりました。
これでは緑しか使えないので二重蛍光免疫ができず困っています。

サンプル自体が蛍光を発することってよくあるのでしょうか。全体ではなく、神経細胞の細胞質のみなのですが。長い時間ホルマリンに浸かっていたからでしょうか。

ブロッキングは10%ヤギ血清室温30分、賦活化はProK10μg/ml　37度40分で行っています。
剖検サンプルの蛍光免疫染色に詳しい方、どうぞよろしくお願いします！
　
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No.808-8 - 2008/03/21 (金) 20:20:30 - kata
UVを一時間で、さらにオーバーナイトでかけてみましたが蛍光はあまり減少しませんでした。
今度はautofluorescence eliminatorを購入して試してみようと思っています。
しかしこれは、リポフスチンによる蛍光にのみ有効なんですよね。
これで消えなかったら問題はホルマリン固定にあるのでしょうか？
とすると消失させるのは難しいですよね・・・。

(無題) 削除/引用
No.808-7 - 2008/03/17 (月) 17:47:07 - kata
御返答ありがとうございます。
UVを試してみました。
脱パラ前の切片に10分・30分照射の２パターン試してみたのですが、10分ではかえってバックの蛍光が強くなってしまいました。神経細胞自体の蛍光は少し弱まった気もするのですが・・・。結果全体がビカビカに赤く光るという状態になりました。30分ではそのバックの蛍光がやや弱まり少しましになった感じです。
もう少し長くしたら消えるかもしれないという望みの下に1時間照射とか試してみようと思っています。
10分でなぜかえって蛍光が強くなるのかは謎です・・・

autofluorescence eliminatorについても調べて試してみようと思います。
ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.808-6 - 2008/03/13 (木) 17:35:12 - tkdn
autofluorescence eliminatorを使ってみるのはどうでしょう？
以前、肝切片に使用して改善されたことがありました。

(無題) 削除/引用
No.808-5 - 2008/03/12 (水) 14:24:55 - kata
Cy5の波長でも試してみたのですがやはり青く光ってしまいます。
これ以上長波長の色素がないので波長を変えてというのは難しそうです。

UVは脱パラする前に照射するのでしょうね。
今度はUVに挑戦してみます。
また結果をご報告いたします。

(無題) 削除/引用
No.808-4 - 2008/03/12 (水) 12:13:23 - 組織
UV照射を試されるのなら、ぜひ結果を教えてください。
私も参考にしたいので。

ありがとうございます！ 削除/引用
No.808-3 - 2008/03/12 (水) 10:53:49 - kata
早速の回答ありがとうございます。
染めているのはヒトの脳組織なので確かにリポフスチンが豊富ですよね。光っているのが細胞質のみなのも納得です。
示してくださった2つの方法を試してみようと思います。

(無題) 削除/引用
No.808-2 - 2008/03/11 (火) 21:30:04 - 組織
リポフスチンでしょうね。
老齢動物の神経組織では、神経細胞にリポフスチンが蓄積していることがよくあります。
質問者さんのおっしゃるとおり、リポフスチンは赤系の自家蛍光を示します。

対策としては、標識色素を長波長のものに変えます。
http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?start=1;mode=view;Code=3651
Cy3を長波長に変えれば、なんとか二重染色できるのではないかと思います。

あと、染色前に切片を紫外線に当てて組織由来蛍光物質を退色させる方法もあるようです。
http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;start=1;Code=566
私は試したことがないので、これでリポフスチンの自家蛍光が抑えられるかはわかりませんが。

剖検サンプル自体が発する蛍光 削除/引用
No.808-1 - 2008/03/11 (火) 20:28:56 - kata
蛍光抗体を付けなくても、ホルマリン固定した剖検サンプルは蛍光を発するものでしょうか？！

現在剖検組織（脳）の切片（ホルマリン固定、パラフィン包埋）を使って二重蛍光免疫染色をしています。
二種類の一次抗体（mouse、rabbit）を用い、それぞれの二次抗体にFITC、Cy3をつけたものを使用しています。

二種類とも神経細胞の細胞質でmergeしたのですが、一次抗体をなしにしても同部位が赤い光を発するのです。二次抗体が直接ついているのかと思い一次抗体、二次抗体なしでレーザー顕微鏡で見てみたら、なんとやはり神経細胞の細胞質のみが光るのです。

調べてみたら赤・青共に光ることがわかりました。
これでは緑しか使えないので二重蛍光免疫ができず困っています。

サンプル自体が蛍光を発することってよくあるのでしょうか。全体ではなく、神経細胞の細胞質のみなのですが。長い時間ホルマリンに浸かっていたからでしょうか。

ブロッキングは10%ヤギ血清室温30分、賦活化はProK10μg/ml　37度40分で行っています。
剖検サンプルの蛍光免疫染色に詳しい方、どうぞよろしくお願いします！
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