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(無題) 削除/引用 No.802-9 - 2008/03/21 (金) 19:59:03 - 免疫 Caspaseさん 返信ありがとうございます． ラットでも部分採血は可能ですよね． ただ，実験動物を扱うのが不慣れな点と抗体価があるだろうという慢心で全採血しました． 命を落としたラットに申し訳ないです．

(無題) 削除/引用 No.802-8 - 2008/03/21 (金) 18:09:00 - Caspase すみません、ラットでしたね。読み間違えました。 ラットでも試験採血は行えるかと思うのですが...

(無題) 削除/引用 No.802-7 - 2008/03/21 (金) 18:07:56 - Caspase 免疫の期間中、試験採血は行われていますか？ プロトコールだと免疫、いきなり全採血、抗体価測定と読み取ったのですが... ウサギは耳静脈から比較的簡単に部分採血が行えます。 私の場合は免疫期間中試験採血を行い、ドットブロットもしくはウエスタンブロット法で抗体価の測定を行い、抗体価の上がったところでブースト、全採血という感じで抗血清を得ました。

(無題) 削除/引用 No.802-6 - 2008/03/20 (木) 16:20:52 - 免疫 皆さんご教授ありがとうございました． 用いた抗原は組み替え等ではなく魚類の骨格筋構成タンパク質の一部です． サブユニットの1部だけを認識する抗体を作りたかったので，ゲルを切り出して抗体作成を試みました． adjuvantはDIFCOのFreunds Complete Adjuvantを用いました． 抗原量は初回1 mg/1匹，追加ブースターは0.5 mg/1匹で行いました． オクタロニーやwestermに用いた抗原は免疫源と同じです． もし，実験手法に問題がないのなら，rabbitでもう一度やってみます．

抗原 削除/引用 No.802-5 - 2008/03/17 (月) 20:56:13 - 仕事中 皆さんの意見と同じなのですが。 一番の問題は抗原にあるように思えます。 1. 蛋白量にしてどの程度を免疫していますか？ 2. 抗体価測定で用いている抗原は免疫原と同じものですか？　変性蛋白で免疫することでNativeに反応する抗体が得られない場合もあります。 純度が低いためにバンド切り出しを行っているのだと思いますが、それでは抗体が作製できない場合は、夾雑蛋白ごと免疫して得られた抗血清を抗原カラムで精製するという方法もあります。 まずは抗原について以下の情報を教えてもらえますか？ a. 免疫した量（よければアジュバントについても） b. Native or Recombinant？（Tag付き？） c. ゲル切り出しをしている理由 d. オクタロニーやWBで用いている抗原は免疫原と同じか？

(無題) 削除/引用 No.802-4 - 2008/03/14 (金) 17:48:46 - a 抗原に用いた蛋白質は大腸菌などで生産した組換え蛋白質ですか？ それともまったく別の物ですか？ fusionまたはタグのようなものはついていますか？ もう少し抗原に関する情報を書いてください。 > ゲルからタンパクを抽出する必要性はないのか？ ゲルのままでも、できるものはできますよ。 > SDS-PAGE変性させた状態のタンパクで抗体ができるのか？（できれば結果All rightって感じですが・・・タンパクによるでしょう） できた抗体が変性条件下でしか認識しないことはあると思います。 つまり、ネイティブ条件での免沈には使えないとか。

(無題) 削除/引用 No.802-3 - 2008/03/10 (月) 10:54:43 - りょう ねずみさんの意見に付け加えて： ゲル断片を使用されているのでしょうか。 ゲルからタンパクを抽出する必要性はないのか？ SDS-PAGE変性させた状態のタンパクで抗体ができるのか？（できれば結果All rightって感じですが・・・タンパクによるでしょう） 3回の免疫で充分な抗体価が得られるのか？僕なら5回くらいまで粘ります。 westernなど確認実験に問題はないのか？

(無題) 削除/引用 No.802-2 - 2008/03/10 (月) 03:57:56 - ねずみ いろいろな可能性が考えられると思います。 １）免疫した目的蛋白の量が少なすぎる。 ２）一般的にラットではウサギやモルモットに比べて抗体ができにくい（これは聞いたことがあります）。 ３）腹腔内注射では抗原が長期間とどまりにくいので免疫されにくい。皮内注に変えてみる。 ４）そもそもその蛋白では抗体が産生されにくい。 などです。 つまり、私がもう一度やるなら、抗原の量を増やして、ウサギかモルモットに皮内注で免疫すると思います。

ポリクローナル抗体作成 削除/引用 No.802-1 - 2008/03/09 (日) 14:14:38 - 免疫 いつも拝見させていただいています． 先日，あるタンパク質をラットに免疫してポリクロ抗体の作成を試みました． 得られた抗血清に対して抗体価を調べたところ全くありませんでした． 単純に抗体が生成されなかったと思うんですが，どのようなことが原因なのでしょうか？ 具体的な手順は以下の通りです． あるタンパク質をSDS-PAGEにて分離． 通電後，0.6 M KClにてバンドの検出． 目的のバンドを切り出しPBSで洗浄(10 min×3) アジュバントとバンドを混合してエマルジョン形成． ラットをジエテルエーテルで麻酔し，覚醒する前に腹腔内に注射． 3回ほどのブースタ後に抗血清を得て，抗体価のチェック(オクタロニー法，western blot法)． 上記の手順で何か間違いはありますでしょうか? ご教授お願い致します．

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