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(無題) 削除/引用 No.799-4 - 2008/03/12 (水) 11:14:46 - ~ >�D 私は要事調整しています。 >フラスコのキャップ エアレーションが悪いと増殖も悪くなります。 (増えないわけではないですが) フラスコの蓋を緩めるか、スポンジ状の栓を使用しています。 (蓋を閉める＜蓋を緩めておく＜スポンジ栓 でした) >加湿 閉鎖系であれば、問題があると言われることは無いと思います。 私は開放系で培養していますが、加湿していません。

ありがとうございます。 削除/引用 No.799-3 - 2008/03/11 (火) 22:19:49 - Sf初心者 遅くなりましたが、丁寧に回答していただきありがとうございます。 確かに、一から始めていくのは正直かなり無謀な気がします。 一応、周りに動物細胞を扱っている人はいますが・・。 では、更なる質問となってしまうのですが、回答していただけると嬉しいです。 �Dのストック液は、4℃保存でいいのでしょうか？ あと、昆虫細胞はCO２不要ですが、フラスコのキャップは完全に閉めてしまって良いのでしょうか？サスペンション培養では、大腸菌の培養みたいに空気が入るようなスポンジのような蓋が必要なのでしょうか？ また、加湿が必要という資料があったのですが、これはディッシュにまく場合に、培地が蒸発してしまうのを防ぐ為ですよね？となると、閉鎖系のキャップをしての培養の場合は、気にしなくていいということでしょうか？ 宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.799-2 - 2008/03/09 (日) 15:19:18 - ~ 周りに経験者がいなくて、これらの疑問点を掲示板で得ようとするのはかなり無謀だと思いますが‥ >�@ Sf900は血清無しで買うことができる培地ですが、 通常は、血清入り培地で培養している細胞を直接血清無し培地に継代しても育たないと思います。 おそらく、血清入りで飼っていた細胞のストックを直接血清無し培地に起こしたら、増えてこないと思います。 上記の、血清入り培地で増やして、血清無し培地でたんぱく質を作らせるというのはおそらく、 血清入り培地の方が増えがいいので血清入りで増やして、 最後に回収する際には血清があると精製の邪魔になるので血清無しで培養し、細胞が死ぬまでの間たんぱく質を作らせているのだと思います。 (死なずに増えるかもしれませんが) 起こす際には、まずはストックと同じ条件で起こして、それから血清を抜くかどうかを検討すればいいと思います。 一度血清無しで増えるストックを作っておけば、今後は血清無しで起こすことができます。 メーカーにメールすれば、血清無しへの馴化手順を教えてくれるはずです。 >�A 無菌操作ができるのであれば、ビンやピペットの種類は関係ありません。 容器から何かが溶け出してくることを心配しているのではないですよね？ 心配ならば、砂糖水か何かで10回くらい同じ操作をしてコンタミするかを確認してはいかがでしょうか。 もっと心配ならば、500mLのボトルトップフィルターを用意して、ディスポの50mLピペットを1回とるごとに使い捨てて10本使えば、元のボトルのコンタミの確率も下がります。500mLx2のボトルトップフィルターにそれぞれ分注すれば、より簡単です。 >�B 血清無しであれば、おそらくディッシュの底に張り付きません。 (ディッシュがコラーゲンなどでコーティングされていれば別ですが) 血清入りであれば、張り付くでしょうが、ピペッティングではがせると思います。 操作しにくいのであれば、先端を曲げた駒込ピペットを自分で作れば、はがしやすくなります。 カウント時に細胞の凝集塊は出ないくらいにピペッティングで分かれると思います。 >�C サスペンションカルチャーは操作が容易です。 上記のフラスコを縦にして振倒すれば何とかなります。 T175の代わりに、T125の三角フラスコ型のフラスコを使ったほうが、振倒は効率よく行われると思います。 >�D それでも起きてくると思います。 ベストの条件検討をしないのであれば、それで十分だと思います。

昆虫細胞の培養 削除/引用 No.799-1 - 2008/03/09 (日) 10:21:08 - Sf初心者 昆虫細胞（Sｆ２１細胞）＆バキュロウイルスを用いたタンパク質発現をすることになったのですが、、 細胞培養自体が全く初めてで、以前に私の所属する施設で行われていた様々なプロトコールなどを見て、実験計画を立てています。 そこで、試しにフリーズストックしてあるSf２１細胞を起こしてみることになったのですが、 現在、昆虫細胞の経験者がいないので、手探り状態です。 �@無血清培地Sf900�U-SFM（Gibco）は基本的には血清なしで培養可能？のようですが（カタログより）、以前に行われていた方の記録では、Sf900�U+５％FCS＋100μｇ/mLカナマイシン（Km）で行っており、精製の前の大量発現の時に、無血清（Sf900�U＋Km）にしているようです。やはり、無血清培地でも血清を入れた方が、育ちは良いので、結局血清を入れた方がいいのでしょうか？ �Aまた、液体のSf900�U（滅菌済）を購入したのですが、全体にKmを加えてから、半分は血清入り、残り半分は血清無しで使いたいとした場合、血清無しのものを別容器に移したいのですが、滅菌したmedium瓶にそのまま移してしまってはダメでしょうか？（ろ過滅菌する必要があるのでしょうか？） ちなみに、血清やKmはガラスの滅菌済ピペットやP1000のチップを用いて（直前に火炎滅菌）いいのでしょうか？ガラスピペットではなく、ディスポのプラスチック製品を用いた方がいいのでしょうか？ �B細胞融解後、T２５-フラスコ→T７５-フラスコ→T175-フラスコ（単層培養？）→1000ml スピナーフラスコ（浮遊培養）と考えているのですが、Tフラスコの場合、細胞を剥がすのピペッティングでいいのか、ラバークリーナーを使うものなのか、どちらが一般的なのでしょうか？また、細胞をカウントする時も、細胞を剥がしただけでは、十分懸濁されていないと思うのですが、ピペッティングしてしまって大丈夫なのでしょうか？ �C培養方法は�Bのように考えていますが、もし、一番、簡単というか、増えやすい培養方法があれば教えて下さい。どこかでサスペンション培養が簡単とあったのですが、フラスコ等はどんなものを使えば良いのでしょうか？ �D幾つかストックを作っておきたいのですが、ストックの液は15％DMSO＋medium（血清入）で宜しいでしょうか？資料によって、違うもので・・。 細胞に関して超初心者でして、沢山の質問で申し訳ありません。 どれか１つでもお答えいただけると嬉しいです。 宜しくお願い致します。

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