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(無題) 削除/引用 No.795-7 - 2008/03/13 (木) 19:57:42 - R 発現しているかしていないかを論じるなら、プラトーになるサイクル数で見た方が良いかと思います。 参考にされた論文はおそらく、幾ばくかの定量性を持たせて論じたかったのではないでしょうか。 （例えば、isoform Aは臓器1より2で発現が高い、臓器1ではisoform AよりBの方が発現レベルが高い） 定量性を持たせたいなら、やはり対数期で見るべきでしょう。 real-time PCRで濃度をふってスタンダードを測定すると、 最初の立ち上がりもですが、明らかにプラトーに達するサイクル数は異なります。 鋳型以外の因子もプラトーに影響するとは思いますが、 鋳型依存的にもプラトーに達する時期は変わってきます。 同時にPCRかけた際に、プラトーに達したときの産物量はどの産物でも同じ感じですが、プラトーが同時に起こるとはにわかには信じられません。 1 tubeの中でmulti-plex PCRならそうなることもあるかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.795-6 - 2008/03/13 (木) 10:46:49 - やまちゃん すいません。作成中に送信ボタンを押してしまいました。 ＞ですから比較するにはプラトーまで回せというまたオーバーサイクルで目的のバンドよりも高分子のバンドが出現することがよくありますが、これはできた産物がプライマーの働きをして起こるものと解釈しています。 ですから比較するにはプラトーまで回せという意見には賛成できます。 です。

プラトーは同時に起こる 削除/引用 No.795-5 - 2008/03/13 (木) 10:43:33 - やまちゃん という論文があります。PCRのプラトーはいまだにその原因が明らかにされていませんが、プライマーの枯渇、酵素の機能低下などが言われています。言われている要因のほとんどが鋳型に依存しないのと、経験的に同時に起こっているような気がするのでいままでそう信じてきました。ですから比較するにはプラトーまで回せというまたオーバーサイクルで目的のバンドよりも高分子のバンドが出現することがよくありますが、これはできた産物がプライマーの働きをして起こるものと解釈しています。

検出限界 削除/引用 No.795-4 - 2008/03/08 (土) 06:46:42 - extra band いまから十数年前は、PCRで発現比較をする際は、出来るだけ少ないサイクルかつ対数増殖中のデータを使う、できればコピー数が分かるスタンダード（ターゲットと少しだけ長さの違うin vitroでtranscriptionしたRNA)も用いるのが半定量PCRのやりかたでした。感度の不足はprimer5'をRI標識したサンプルをアクリルアミドで泳動して補っていました。 ですから25サイクルでプラトーを避けて、やめるのは間違いではないですが、コピー数が分かるスタンダードを入れていないので、何コピー以下という推定は、まして発現なし（１コピー以下）というのは言うのが難しそうではあります。検出限界以下の発現というのが言い方としては正しいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.795-3 - 2008/03/07 (金) 23:38:00 - GSPs すいません、 ”発現量を比べるのが目的ならばその参考論文のようにsemi-qPCRでも場合によっては可能です（実験条件によります）、” は無視して下さい。

(無題) 削除/引用 No.795-2 - 2008/03/07 (金) 23:36:13 - GSPs ＞これで本当に発現していないというのは言えるのでしょうか？（逆に考え＞ると３０−３５サイクルにするとバンドが出るので低サイクルにしたんじ＞ゃないかと考えてしまいますが）。 参考にした論文を見ていないのでなんですが、その参考論文の結論には同意しかねます。35から40サイクルまわしてもある遺伝子は発現が認められ、ある遺伝子は発現が認められないのであればその参考論文の結論はいいのかもしれません。発現量を比べるのが目的ならばその参考論文のようにsemi-qPCRでも場合によっては可能です（実験条件によります）、 ＞もうひとつ、RT-PCRで発現量を半定量的に比較する場合にはプラトーに達＞しないサイクルで比較したほうがよいのでしょうか？（以前学会で３０サ＞イクルでPCRを行っていたところプラトーになるまでサイクルを増やさない＞と発現量を比較できないと質問されたことがあったものですので）。 その質問は本当ですか？ ”プラトーになるまでサイクルを増やさないと発現量を比較できない”は、逆に比較できないと思いますよ。だって20サイクルでプラトーになるgene Aと30サイクルでプラトーになるgene Bでは明らかに後者の方が発現量は高いのでは。 semi-qPCRでは最初にサイクルナンバーを振って、band densityが真ん中くらいのを選んでやると思います。realtime-PCRならば勝手にやってくれるでしょうけど。

PCRのサイクル数の設定について 削除/引用 No.795-1 - 2008/03/07 (金) 22:05:06 - ぴ−しーあーる いつも参考にしております。 あるタンパクに３種類のisoform（A,B,C）が存在することが知られています。各臓器にどのタイプのものが発現しているかをPCRにて調べようと考えています。 参考にした論文によるとPCRは２５サイクルで行っておりなぜ低サイクルにしたかという説明に、プラトーに達するのを避けるために低サイクルにした、という記述がありました。そのサイクルである臓器にはAとBが発現しているがCは発現していないと結論づけておりました。 これで本当に発現していないというのは言えるのでしょうか？（逆に考えると３０−３５サイクルにするとバンドが出るので低サイクルにしたんじゃないかと考えてしまいますが）。 もうひとつ、RT-PCRで発現量を半定量的に比較する場合にはプラトーに達しないサイクルで比較したほうがよいのでしょうか？（以前学会で３０サイクルでPCRを行っていたところプラトーになるまでサイクルを増やさないと発現量を比較できないと質問されたことがあったものですので）。

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