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(無題) 削除/引用 No.794-12 - 2008/03/26 (水) 00:07:23 - おお >[Re:11] trypsinさんは書きました : > EDTAによる細胞剥離ですが、ラボのポスドクの話では純水でEDTAを希釈して作るとのことでした。 これは確かに間違ってますね。普通はPBS(ー)に1mMぐらいのEDTAを加えたものを使います。トリプシン-EDTAもPBS(ー)、1mMEDTAにトリプシンが入っていると思います。

(無題) 削除/引用 No.794-11 - 2008/03/25 (火) 21:54:47 - trypsin EDTAによる細胞剥離ですが、ラボのポスドクの話では純水でEDTAを希釈して作るとのことでした。しかし、このままでは塩濃度が低いため、細胞に水が流入し形態を変化させるばかりか、比重の低下によりPBSで洗う際の遠心でなかなか落ちてこなくなります。調べてみると http://www.j-tokkyo.com/2004/C12N/JP2004-135571.shtml 特許のサイトですが、ここで紹介されているEDTAをPBSで希釈する手法を導入したところ、形態変化も起こりにくく、細胞の回収率も向上しました。 ご参考までに。

(無題) 削除/引用 No.794-10 - 2008/03/22 (土) 11:27:14 - ポスドク 皆さんが意見を出されているのとほとんど同じなのですが、 自分の場合は、 RNA：PBSにてwash後にTRIzolなどのRNA抽出用試薬を入れて、５分放置後にセルスクレーパーで回収 protein: PBSにてwash（２〜３回）後に、SDS sample bufferなどのタンパク用bufferを加えて、セルスクレイパーで回収 としています。

細胞剥離 削除/引用 No.794-9 - 2008/03/22 (土) 10:27:10 - CDS 私は、Cell dissociation solution (sigma)と言うのを使っています（中身は不明なのですが、この方法のことを先生がEDTAと呼ぶので、EDTA法と同じかもしれません）。 基本的には、ラベルしたリガンドを細胞表面への結合させ、フローサイトメトリーでアッセイする時に、この試薬を使って細胞を剥がしています。 この試薬とPBS/スクレープの2種類の方法で蛋白質の抽出し、Native-PAGEで解析したこがありますが、分解しやすい等の違いは見られませんでした。ただ、ラベルしたリガンドの泳動パターンなので変性ついてはわかりません。

トリプシンの影響は 削除/引用 No.794-8 - 2008/03/22 (土) 09:13:42 - trypsin 報告が遅れて申し訳ありません。 比較的トリプシンに弱く、使っているトリプシン濃度も他の細胞の10分の1の細胞では、薄いトリプシンを使っているにもかかわらず、観察している蛋白の誘導が見られました。一方スクレイパーを使った場合にはこの現象は見られませんでした。 それ以外の細胞の場合は、差があるのかないのか難しいところです。 ところで最近EDTAのみで細胞をはがす方法を同じラボの人に教えてもらいました。残念ながらトリプシン感受性の細胞はこの方法でははがせませんでしたが。扱っている他の細胞ではトリプシン処理のほぼ3-5倍の時間ではがれました。ひとつのフラスコから非変性蛋白とRNAを取りたい時があるので、重宝しそうです。 EDTAを用いた細胞はがしは、どんな点に気をつければいいでしょうか？金属イオンをキレートするので、関連する蛋白は影響を受けそうですが...。

(無題) 削除/引用 No.794-7 - 2008/03/08 (土) 09:09:45 - trypsin 皆様、ありがとうございます。まずは蛋白から、トリプシンの影響がターゲット蛋白にどれほど影響があるか調べてみます。 抗体がラボメイドなので特異性を証明するために、蛋白を免疫沈降、ゲル泳動して他のラボにMass Spec解析をしてもらう予定です。また免疫沈降を、細胞、組織の免疫染色に使えているかどうかの指標にもしたいため、現時点ではあまり強い変性は避けたいです。 特異性証明後はウエスタンが中心になると思うので、RNAeasyからの蛋白回収やTrizolでのDNA、RNA、蛋白抽出などの情報はありがたかったです。 ところでピエールさんがお書きになった ＞タンパク質の場合は目的によって取り方がちがいますが、 Westernなら直接＞Loading Bufferをかけてしまっても構いません。 この際、蛋白の濃度はBCA法で測るのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.794-6 - 2008/03/08 (土) 01:53:49 - おお >[Re:5] ピエールさんは書きました : > RNA抽出は下の方が述べているように PBSで洗わずにTrizolを直接かけて溶かすのがいいと思います。。 > > タンパク質の場合は目的によって取り方がちがいますが、 Westernなら直接Loading Bufferをかけてしまっても構いません。細胞は洗わなくても結構ですが、血清由来のBSAが泳動の邪魔をする場合があるので、PBSで洗うのが無難です。 そうなんですよね。RNAだけが目的の時は洗わずとしたいわけですが、そのライセートからタンパクも解析しているので、PBSで洗わないと気持ち悪いというのがあります。血清抜きのバイチで洗うまではやってませんね。 あと洗う時は冷やしたPBSを使う必要はないと思います。洗うという操作に敏感な遺伝子もあると聞いたことがありますので、洗う場合は即座に洗って、直ぐにlysis bufferを加えるのがいいと思います。実際あなたの実験でどのぐらいの差が出るかチェックしてもいいかもしれませんね。 トリプシン処理はカナリアーチファクトが出ると思います、膜タンパクの分解とか場合によっては除き切れなかったトリプシンが、細胞内のタンパクを分解させる可能性もありますから。細胞のシグナリングに関しても、まず細胞表面のタンパク分解、そしてその後、遠心などと時間をかけている間に変わってくる可能性があります。

(無題) 削除/引用 No.794-5 - 2008/03/07 (金) 17:02:09 - ピエール RNA抽出は下の方が述べているように PBSで洗わずにTrizolを直接かけて溶かすのがいいと思います。もっと精製度の高いRNAが取りたかったらQiagenからもRNeasyなどのキットがありますが、Real-time RT-PCR程度でしたらTrizolで十分だと思います。 タンパク質の場合は目的によって取り方がちがいますが、 Westernなら直接Loading Bufferをかけてしまっても構いません。細胞は洗わなくても結構ですが、血清由来のBSAが泳動の邪魔をする場合があるので、PBSで洗うのが無難です。 非変性状態で取って、Co-IPや活性を見る場合は少しややこしくなり、界面活性剤(NP-40など)を使うか使わないかは実験の性質と目的タンパク質の性質によって条件が全然ちがうのですが、一度Dignam et al.のNucleic Acids Res. (1983)を読んでみるといいと思います。キモは核内のタンパク質は高塩濃度で溶出される、ということです。 トリプシンはご存知のようにタンパク質分解酵素なので、タンパク質取りにはお奨めしません。 下の方のようにPBSで洗ってスクレーパーで物理的にはがして回収が常道だと思います。

(無題) 削除/引用 No.794-4 - 2008/03/07 (金) 15:24:20 - とも RNAなどの発現を見る場合は直接ディッシュにlysisバッファーを入れた方がいいですよ。PBSなどで洗ったりもさけた方がいいです。 以前マイクロアレイをやっていて、冷たいPBSなどで細胞を洗っただけで、結果が大きく変わってしまったことが、一度ではなく何度もありました。洗うだけで結果が変わってしまうので、はがすなどの行為はあまりやらない方がいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.794-3 - 2008/03/07 (金) 14:04:55 - おお 核酸はDNAですか? RNA抽出試薬のtrizolはRNAと同時にタンパク、DNAを回収できることになってます。マニュアルを参考にしてください。trizolでRNAの精製がをしたくないのであれば、trizolにクロロホルムを加えた上製にイソプロを加えた後にキアーゲンのカラムに載せるてもあります。DNAについてはどの程度いいのか分かりませんが、タンパクはまぁ大丈夫かなとおもいます。 またはRNA精製用のキット(キアーゲンやGEなど)で、サンプルをアプライして、スルーした溶液に4倍量のアセトンを加え沈殿させると言うのも回収はできます。これはキアーゲンのマニュアルのオプションとして載っていたような気がします。これだとDNAは回収できません。 上記の方法は、接着細胞の場合、ディッシュごとPBSであらい、RNA回収用のlysisバッファーで処理するので、刺激は最小限です。 TCAは優れた方法で、愛用している方はまあまあいるんではないでしょうか。 ただし、上記の方法は申し上げるまでもありませんが、変成してしまったタンパクしか取れませんのでSDSPAGEやウエスタンぐらいにしか使えませんけど。

(無題) 削除/引用 No.794-2 - 2008/03/07 (金) 13:51:21 - あま やはり培養状態からいち早く細胞を壊して所定の変性溶液に入れてしますのがのがベターと思います。 間違った方法かも知れませんが私の場合、 mRNAは、培養上清を捨てて、そのシャーレにRNA用Lysis Bufferを加えスクレーバーで回収しすぐホモジナイズ。 タンパクは、培養上清を廃棄しPBSを加えスクレーパーで回収、その後Protein用Lysis Bufferで処理。 参考までに。

蛋白、RNAを取る際の接着細胞のはがし方 削除/引用 No.794-1 - 2008/03/07 (金) 13:23:42 - trypsin 私のいるラボでは接着細胞から蛋白や核酸を抽出する際、トリプシン処理してフラスコからはがし、PBSで洗って使っています。しかしトリプシン処理で細胞に何らかの変化は起きるはずなので、あまりいい方法ではありません。TCAを使って細胞を一時的に固定してからスクレーパーではがす方法がありますが、これは一般的に用いられていますか？またこのほかに、細胞をはがす際の刺激や応答を減弱させる方法はあるでしょうか？ ご意見をお待ちしております。

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