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ちょっと麹 削除/引用 No.784-5 - 2008/03/07 (金) 11:51:13 - ema 米麹でアウリントリカルボン酸(ATA)とCTABを使って多糖除去しているのがあります。 Isogen使ってないからとるとこからですが。 自分ではLPSリッチのものをcDNAライブラリ作りたくて検索してCTABで処理したことはあります。 www.nfri.affrc.go.jp/research/seika/seikah16/pdf/h16p36.pdf

(無題) 削除/引用 No.784-4 - 2008/03/06 (木) 23:38:07 - カナマイシン AP様、ぐらむ+様。ありがとうございました。 >AP様 有益な情報をありがとうございます。 やっぱりモレクロはすごいですね･･･ そしてやはり多糖類は憎たらしい。 で、私は今後結局どうするかというと、 やはりAP様と同様水溶性画分にだいたいのRNAがきていると信じて 今まで通りやっていこうと思います。 >ぐらむ+様 「メーカーの推奨するギリギリの量」でやっております。 ただ、その「ギリギリの量」は多糖の多いバクテリアなんかを想定したものでは 当然ないと思うので、次回は半量くらいでやってみようかなと思っています。

(無題) 削除/引用 No.784-3 - 2008/03/05 (水) 18:00:40 - ぐらむ+ 以前菌を扱っていました。 あまり問題解決にはならないかもしれませんが、 かなり抽出試薬の許容量を超えた菌数を処理していませんか？ あまりに多いサンプルを処理しますとゴミ？が残存すると思います。 クロロホルムを加えた後の水層を２〜３回フェノクロを振ってみるのはいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.784-2 - 2008/03/05 (水) 17:59:14 - AP 多糖類の可能性が高いと思います。 Trizol, IsogenともChomczynskiの原法に基づいていますが、これだと多糖類がRNAとco-purifyされやすいと言うことが知られています。 原法で0.5 vol iProOHで沈殿するところを、0.25 vol iProOHと0.25 vol RNA precipitation solution (1.2 M NaCl/0.8 M disodium citrate,12H2O)で沈殿すると多糖類のコンタミを防ぐことができるそうです。 Molecular Biology 3rd ed.には載っていますが、原著はhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7541213?ordinalpos=1&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum 既に精製してしまったRNAに多糖類がコンタミしている場合はLiCl沈殿などでも精製できますが、多かれ少なかれ、ロスは覚悟しなければならないでしょう。 沈殿にトラップされているRNAがあったとして、どちらがロスが大きいかということを考えると、、、、、 私は、よっぽどひどい状態でなければ（たとえば溶液全体がジェリー状になるとか）、多少の不溶性の沈殿が残ってもRNAの大部分は溶出していると信じて、上澄みだけ使います。

ISOGEN/Trizol 法で調製したRNAの不溶性ペレット 削除/引用 No.784-1 - 2008/03/05 (水) 14:45:49 - カナマイシン いつもお世話になっております。 ISOGEN/Trizol 法でバクテリアからTotal RNAをよく調製します （実際使うのはISOGEN）。 しかし、最終ステップのエタノール沈殿→70%エタノール洗浄後、 どうしても不溶性の白いペレットが残ります。 よく「ペレットを乾燥させすぎると溶けなくなる」と聞きますが、 あまり乾燥させないままホルムアミドに溶解させようとしても溶けません。 水でも同じようです。加熱・撹拌等しても溶けません。 上清を取ると、いちおうRNAは回収できていますが、 多量のRNAを必要とする実験なので、収量が落ちているかと思うとやるせないです。 そこで質問なのですが･･･ ・正体はなんでしょうか？　やはり多糖ですか？ 　ちなみにかなり「汚い」バクテリアなので、多糖は多く含まれているとは思います。 ・そのペレットの中に、RNAも含まれているでしょうか？ ・解決法はありますでしょうか？ 以上、ご教授いただければ幸いです。

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