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内部コントロールについて 削除/引用 No.777-30 - 2009/06/17 (水) 21:39:39 - バルサ 胎仔期からadultまでの、脳でのある遺伝子の発現量変化をリアルタイム PCRで見ているのですが、内部コントロールが安定していません。同じような実験をしている方がいたら、どの遺伝子を用いているか教えてほしいのですが・・・。ちなみに自分はβ-actinを使っています．

(無題) 削除/引用 No.777-29 - 2008/03/16 (日) 03:08:28 - おお 最後にインターナルコントロールは変化しないのが理想的ですが、実際動きます。ですから細胞や実験系によっては使えないものもあります。それとどれくらい動く遺伝子を見るかにもよってきます。またデーターをどのように使うかにもよってくると思います。 逆に世の中にあるこの手のデーターは実際に発現量が変わったというデーターではなく、ある(おそらく信用のおける)インターナルコントロールを基準に変化があるので、発現量に変化があるだろうと言うsuggestionでしかありません。もちろん、そのあとウエスタンや転写活性その他の実験をしてもっと確かなデーターを出している文献もあると思います。 リアルタイムでそれぐらいはぶれるだろうというのは、ほかの人と同意見ですが、MACさん自身の実験ですので、だから大丈夫と簡単に決めつけず納得行くように進めるといいかと思います。いい結果に結びつけばいいですね。 (収まり切らなかったので2つに分けてます。すいません長文で、、、、)

(無題) 削除/引用 No.777-28 - 2008/03/16 (日) 03:07:12 - おお 話が平行せんですね。私は一定のRNA量をとってリアルタイムPCRをしても立ち上がりのサイクル数がぶれることはあると思います。 でもどの程度が分かりませんが、、、 サイクル数がひとつずれたという事は2倍違うと即座に考える前に2つほど考慮した方がいい事があると思います。まずはサイクル数のぶれは、nサイクルに対してn-1かn+1しかないわけです。立ち上がりのサイクル数が0.5変わるというのはあり得ないわけです。ですから10%の違いが若干立ち上がりに影響したとしても立ち上がりのサイクル数で見れば１サイクル狂うこともあり得ますね。 もう一つはPCRは理想的に１サイクルで2倍ですが、実際は2になる事は珍しいです(私は詳しくは分かりませんが1.6-1.7ぐらいでしょうかね。もちろんプライマーに依存しますからまちまちでしょうけど、コンディションによるでしょうから各サンプルで一緒かも一度見た方がいいかもしれません)。あと立ち上がりのサイクル数ですが、どのくらいのシグナルで立ち上がったと判断するかによって可也違った値が出る可能性があります。もし、インターナルコントロールでもそのほかの遺伝子にしても変化しないと自身がある状態なら立ち上がりのシグナル強度に関して最適値を再考してみてもいいかもしれませんが、質問の意図は変わっているかもしれないと言う事なのであまり助けにはならないと思いますが、、 ですから、一定RNA量でインターナルコントロールの立ち上がりのサイクル数が変わったから即座に量が変わったという事は出来ないと言うことになります。 ではどうしたらいいかですよね。まず再現性がありますでしょうか?いつも立ち上がりが遅れるかどうかです。アルコールの影響も考えているわけですから、アルコール非存在下のコントロールも取られた方が納得が行くかと思います。 再現性が取れないのであればぶれの範囲と取っていいかと思います。 もし再現性があるならどうすればいいかですが、その場合はその他の方法で実際に動くか、またどの程度動くかを確認するのが妥当だと思います。多分違う実験か、文献など公表されたデーターとかです。でそれほど変化しないという事であればここでリアルタイムPCRを使うかどうか決心しないといけない訳です。たとえば、そのインターナルコントロールを使って、動くと分かっている遺伝子がその様にリアルタイムPCRで結果が出るかです。特に下がる遺伝子をこの場合は見るべきでしょう。 MACさんはリアルタイムPCRはそれぐらいぶれるもんだと簡単に決めつけず慎重にやられてますので、その態度で取り組めばきっと本当の実験にたどり着けるのだろうと思います。たいていの人は与えられたプロトコールとうりにやって問題しせずにとおり過ぎてしまうところです。それでも大丈夫な場合のほうが多い(いい意味でも悪い意味でも)のは確かです。

(無題) 削除/引用 No.777-27 - 2008/03/15 (土) 01:30:27 - う〜んと コンフルになってからさらに数日間培養を引っ張ったら、それだけでRNA量が減りませんか？エタノールの影響もあるかもしれませんが、エタノールを入れないコントロールも必要では？ 18SはトータルRNA量とパラレルに近い数字を返すと思いがちですが、結構ずれます。 個人的には、ACTBなんかはcontact inhibitionの影響が大きく出やすいような気もしてます。 すでにお気づきでしょうが、リアルタイムPCRは絶対的な標準がないので、よほど慎重に実験計画を立てて慎重に解釈しないと何をみてるのかわからなくなります。 都合のいいところだけ選び出して結論をすり合わせるなんてことも可能です。 たとえば内部標準をGAPDHにした場合とACTBにした場合とで結果が異なることもままあります。 他人の論文を読む時にも注意が必要だと思います。

うーん．．． 削除/引用 No.777-26 - 2008/03/14 (金) 08:44:02 - 横からPD > > 一方，MACさんのデータではTargetとして18SやHPRTを増幅し，その値だけでもって減少したということを論じようとしているわけです．同じサンプルでも完全に同一の効率でcDNAを準備するのは困難なのに，違う日のサンプルを同じ効率でcDNA準備までもっていけるとはなかなか考えられません．なので，数倍程度の差は当然生じるものと考えられ，この値でもって減少していると結論づけるのは困難と考えられます． > でもRNAの量は一定量用いてcDNAを合成しています。 逆にお伺いしますが，RNA量が一定だったら，cDNAの合成効率やピペッティング（等の操作による）誤差は無視できるとお考えでしょうか？．私としては，用いたRNA量が同じということだけでは，Ct値が同じになることまで保証することはできないと思います． 例えば同じサンプル由来のRNAを10本のチューブに一定量づつわけてcDNAを合成しリアルタイムPCRにかけてみてください．あなたの考えではすべて寸分違わず同じCtを示さなければいけないことになりますが，実際そうなりますでしょうか？ > > エタノールや他の因子の影響というのは，内部標準が減少しているということが明らかになってはじめて質疑として浮上してくるものです． > ここでいう現象というのはCt値のことでしょうか？ ここで言う「減少」については，「誰もが納得する根拠をもって示された減少」としか言えません（それを示すものであればCt値に限らずなんでもよいと思います）．Ct値でも良いですが，誰もが納得する指標を用いた標準化によってちゃんと減少しているということを示す必要がありますよね．少なくとも用いたRNA量が同じというだけでは，あなたの結論（内部標準が減少している）を完全にサポートするとは思えませんので． > 確かにどこかでばらつきが生じそれを補正するためのものが必要だと思います。 > 疑問として、薬物処理後にそれぞれの内部標準が異なっていたら、ターゲットジーンが本当に増減しているのか議論することが難しくならないのでしょうか？ 当然内部標準は動かないことが望ましいでしょう．ここでは誰も「内部標準は減少などしない」などとは言っておらず，各種処理で動き難い内部標準を選択するのは当然と考えていると思います．ですので，「この（これらの）内部標準は0.1%エタノールにて減少する」ということがちゃんと科学的に証明されればそれらは有用な情報でしょう． 話が始まってから大分たちますので，そろそろリピートの結果や，エタノール抜きとの比較結果が出たのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.777-24 - 2008/03/14 (金) 01:07:11 - MAC >[Re:20] 横からPDさんは書きました : > 内部標準として18SやHPRTを利用するのは，比較的細胞内での発現が一定であることからだというのはわかりますよね．動かないとは断定しませんが，刺激によって容易に発現誘導されるようなものではないので比較的安定であると． わかります。 > >細胞の状態、mRNAの抽出効率、reverse transcription効率、ピペット操作など > こういったものによって最終的に準備されたcDNAの濃度は影響をうけるわけです．よって比較的動かないとされる内部標準によって標準化を行ってサンプル間のばらつきを補正するわけです． これもわかります。 > 一方，MACさんのデータではTargetとして18SやHPRTを増幅し，その値だけでもって減少したということを論じようとしているわけです．同じサンプルでも完全に同一の効率でcDNAを準備するのは困難なのに，違う日のサンプルを同じ効率でcDNA準備までもっていけるとはなかなか考えられません．なので，数倍程度の差は当然生じるものと考えられ，この値でもって減少していると結論づけるのは困難と考えられます． でもRNAの量は一定量用いてcDNAを合成しています。 > エタノールや他の因子の影響というのは，内部標準が減少しているということが明らかになってはじめて質疑として浮上してくるものです． ここでいう現象というのはCt値のことでしょうか？ > 細胞の状態や抽出効率が常に完全に一定であるのであれば，内部標準で補正する必要がなくなるのはわかりますよね．つまりTargetのみ測定してそのCtでもって大小を論じれば良いと． > MACさんの実施された18SやHPRTのみを測定してその増減を論じるというのはまさに「細胞の状態や抽出効率が常に完全に一定である」から補正が必要ないという解釈した状態に他ならない訳です．これが成り立つならば，リアルタイムPCRには内部標準が必要なくなるとぽすどくぅさんは言っているのだと解釈します． 確かにどこかでばらつきが生じそれを補正するためのものが必要だと思います。 疑問として、薬物処理後にそれぞれの内部標準が異なっていたら、ターゲットジーンが本当に増減しているのか議論することが難しくならないのでしょうか？

external control 削除/引用 No.777-21 - 2008/03/13 (木) 10:32:11 - やまちゃん internal controlは一定であるという保障はどこにもないので、植物のRNAとかを加えてcDNA合成することがあるそうです。もちろんRNAの量をしっかりと測って、それに見合う量を加えます。internal controlとしてbeta actinやGAPDを使う場合は細胞の状態に応じて発現が変化する可能性はありますが、１８ｓ　リボソームはtotal RNA中でかなりの比率を占めるので、external controlと同程度のコントロールとして使えるのではと勝手に解釈しています。もちろん正規化の基準として全RNA量ではなく細胞数を使う場合は無理ですが。

(無題) 削除/引用 No.777-20 - 2008/03/06 (木) 12:51:11 - 横からPD 内部標準として18SやHPRTを利用するのは，比較的細胞内での発現が一定であることからだというのはわかりますよね．動かないとは断定しませんが，刺激によって容易に発現誘導されるようなものではないので比較的安定であると． >細胞の状態、mRNAの抽出効率、reverse transcription効率、ピペット操作など こういったものによって最終的に準備されたcDNAの濃度は影響をうけるわけです．よって比較的動かないとされる内部標準によって標準化を行ってサンプル間のばらつきを補正するわけです． 一方，MACさんのデータではTargetとして18SやHPRTを増幅し，その値だけでもって減少したということを論じようとしているわけです．同じサンプルでも完全に同一の効率でcDNAを準備するのは困難なのに，違う日のサンプルを同じ効率でcDNA準備までもっていけるとはなかなか考えられません．なので，数倍程度の差は当然生じるものと考えられ，この値でもって減少していると結論づけるのは困難と考えられます． エタノールや他の因子の影響というのは，内部標準が減少しているということが明らかになってはじめて質疑として浮上してくるものです． ぽすどくぅさんの言わんとするところは，おそらく根拠をもって内部標準が減少しているということを示さない限り，エタノールの影響などは論じる意味はないでしょう．．．ということなのではないでしょうか．その根拠になるものとして，18S等を標準化する内部標準の存在などを伺っていたのかと思います． >それ（内部標準で補正しない値）が根拠になるのなら、realtime PCRには内部標準などそもそもいらないことになります。 >すみませんが、わかりません。 細胞の状態や抽出効率が常に完全に一定であるのであれば，内部標準で補正する必要がなくなるのはわかりますよね．つまりTargetのみ測定してそのCtでもって大小を論じれば良いと． MACさんの実施された18SやHPRTのみを測定してその増減を論じるというのはまさに「細胞の状態や抽出効率が常に完全に一定である」から補正が必要ないという解釈した状態に他ならない訳です．これが成り立つならば，リアルタイムPCRには内部標準が必要なくなるとぽすどくぅさんは言っているのだと解釈します． いかがでしょうか？ （なにやらわかりにくい文章ですがスイマセン）

(無題) 削除/引用 No.777-19 - 2008/03/06 (木) 12:49:48 - おお >[Re:14] MACさんは書きました : > 補正は一切しておりません。 減っているというためには、何か全体を(例えば1と)見積もるものが入りますよね。で、その基準を知りたかったわけです。例えばRNAの量を1マイクログラム使ってそういう結果が出たとか。シャーレ１枚に対して量が半分になったと見積もったのかとか。 まずはシャーレ１枚という基準で考えているなら、得られたRNA量は関係なくシャーレ１枚分のRNAまたは10%とかをそのままRTにかけていると言うことになりますね。さて、シャーレからの収量ですが同じ条件でも大きい時は2倍ぐらいぶれる事があります。この状態で2倍の変化を正直に受け入れられるでしょうか? 再現せいよく2倍差があるならある程度信用がおけると考えられるかもしれませんね? で、day2とかのRNA収量が半分になっていた場合どう考えるかですよね。全体のRNA量ベースでは変化がないことになります。どっちが本当でしょうか? で2番目の落とし穴は、RTの時の効率やcDNAからPCRの効率など複数のステップで直接的検証がしずらいのがRT-PCRです。ですからPCRの段階で内部標準がないとだれも信用しないと思います(この点でこのとピの質問内容にたいていのひとが首をかしげている状態なんだろうと思います)。RTの時の効率やcDNAからPCRの効率などがサンプルごと、各チューブのターゲットのRNAごとで違ったらRTPCRの定量は成り立たないではないかと質問されるかもしれません。その通りだと思います。ただし、そういうtotalRNAの中にわざとあるターゲットのトランスクリプトを既知の量入れたりして慎重に検討した系でうまくいっていたりという点でたいていの場合はうまく行くだろうという推測からリアルタイムのRTPCRが使われているわけです。ですから、いまだにリアルタイムPCRの結果を投稿すると、最終的にはノーザンブロットで確かめなさいとレビューアーからコメントが来ることがあるようです。 RTの時のRNA量がちがうと、RNAに対してプライミングするプライマーの量も変わってくる可能性があります。そうすると誤差を生じることになり得ますのでもしシャーレから取ったRNAを定量せずにRTをしているなら、まずRNA量を合わせてRTをした方がいいと思います。 なぜそのようなことを言っているかというと、18Sが半分になるということは、90%以上あるリボソーマルRNAが半分(45%)になってちがうRNAがその分カバーしている状態は考えにくいからです。 もしRNA量を合わせてからRTをしても同じような結果が出るようであれば、もう少し具体的なプロトコールを公開してインターナルコントロールがそれぐらいぶれるものなのかと質問し直した方がいいかと思います。 さて、シャーレあたりのRNA量がへって、それでも(インターナルコントロールで見積もった)トータルRNA量からの割合で減った、増えたを言うのが抵抗あると言う事でしたら、RT-PCRはそういう方法ですので１度ど実験自体を考え直した方がいいと思います。 まだ見えてこない部分がありますので思いついたことを詰込んでおきました。 もう少し具体的なプロトコールを提示した方がいいのではと思います。

(無題) 削除/引用 No.777-18 - 2008/03/06 (木) 12:06:15 - realtime 自分もqPCRを始めて間もない初心者ですが、多少思ったことがあるので書き込ませていただきます。 内部標準といえども、細胞の状態、mRNAの抽出効率、reverse transcription効率、ピペット操作などにより、Ct値1程度のずれは簡単に生じ得ると思います。 したがって、これらによる誤差を補正するために目的遺伝子の値を内部標準遺伝子の値で割るという操作を行っているのではないでしょうか。 ですから、内部標準が2倍程度ずれるのはある意味当然。（10倍、20倍ずれたら問題ですが…） ぽすどくぅさんがおっしゃっているのは、『そんな理想的な標準なんてないんだから、内部標準で補正するしかない』ってことじゃないでしょうか。 初心者ですので、見当違いのことを言っていたら申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.777-17 - 2008/03/06 (木) 07:19:32 - MAC テンプレート量が最初からテクニカルに異なっていることをおっしゃっているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.777-16 - 2008/03/06 (木) 06:23:56 - 横からPD MACさんはまず教科書を読んでリアルタイムPCRを理解されたほうが良いと思います． リアルタイムPCRにはなぜinternal controlが必要かわかれば，ぽすどくぅさんの言わんとするところもわかると思いますよ．

(無題) 削除/引用 No.777-14 - 2008/03/06 (木) 05:53:54 - MAC 補正は一切しておりません。 今回は内部標準を決めるため、Day0、day2、day4とRNAを回収しDNAを合成し、real-timeで発現が一定であるかどうかを測定したかったのですが、day0のCt値と比べてday2ではCt値が大きいため内部標準として適していないのではないかと思っていたので質問しています。 >[Re:11] ぽすどくぅさんは書きました : > 要点が伝わらないのでまずは確認ですが、 > これでは18Sも含めて減少したということなのか、18Sで補正したのかわかりません。 > こちらは最初の発言から、18Sも含めて減少していたと理解したわけですが。どちらでしょうか？ 18sも含めて、GAPDH,Cyclophilin,Actin,HRPTです。 > 18Sも含めて減少していると解釈した場合、何を基準に減少したと判断したのかが不明でしたので、「より信頼のおける内部標準」として何を使ったのかお伺いしたわけです。それに対してこちらからの回答は特にありません。 > >データの値自体が減少している > というのも何を意味しているのか不明確です。やはり「同じようにmRNA抽出してcDNA合成したのにThresholdが1サイクル分ずれた」ということでしょうか。内部標準補正はしない状態で。 減少していると言いたいのは、Day0のサンプルのCt値が15だとしてDay2、day4のサンプルのCt値が16になっているということです。 > 仮に上記の値だとすると、まずはそれ（内部標準で補正しない値）が「約2倍減少した」ことの根拠になるかどうか考えてみてください。これが根拠になるのなら、realtime PCRには内部標準などそもそもいらないことになります。 すみませんが、わかりません。

(無題) 削除/引用 No.777-11 - 2008/03/06 (木) 03:00:40 - ぽすどくぅ 要点が伝わらないのでまずは確認ですが、 >18sがもっとも信頼される内部標準だと思っていました。 >18sやそれ以外のInternalControl(5つ)について発現がday0と比較してDay2,4で同じように約2倍減少していました。 これでは18Sも含めて減少したということなのか、18Sで補正したのかわかりません。 こちらは最初の発言から、18Sも含めて減少していたと理解したわけですが。どちらでしょうか？ 18Sも含めて減少していると解釈した場合、何を基準に減少したと判断したのかが不明でしたので、「より信頼のおける内部標準」として何を使ったのかお伺いしたわけです。それに対してこちらからの回答は特にありません。 >データの値自体が減少している というのも何を意味しているのか不明確です。やはり「同じようにmRNA抽出してcDNA合成したのにThresholdが1サイクル分ずれた」ということでしょうか。内部標準補正はしない状態で。 仮に上記の値だとすると、まずはそれ（内部標準で補正しない値）が「約2倍減少した」ことの根拠になるかどうか考えてみてください。これが根拠になるのなら、realtime PCRには内部標準などそもそもいらないことになります。

(無題) 削除/引用 No.777-8 - 2008/03/06 (木) 01:13:53 - MAC すみません、18sがもっとも信頼される内部標準だと思っていました。 比較したのはday0とday2で、データの値自体が減少していると言っただけです。 その点、他にどういったものが"信頼のおける内部標準"なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.777-7 - 2008/03/05 (水) 12:17:09 - おお >[Re:6] ぽすどくぅさんは書きました : > >[Re:5] MACさんは書きました : > > Internal Controlsよりも信頼のおける内部標準とは何でしょうか？ > ． > Internal Controlが減少していることを示すためには、当然「18SやHPRT等よりも変動しない内部標準」で標準化する必要がありますよね？。 > 私もこの変で引っかかっているわけですが、ようは何を基準に2倍の差があると決めたかということです。私はもしかしたら18Sを基準に取ってるかなと思って探りながら回答してみたのですが、、、、

(無題) 削除/引用 No.777-6 - 2008/03/05 (水) 10:46:42 - ぽすどくぅ >[Re:5] MACさんは書きました : > Internal Controlsよりも信頼のおける内部標準とは何でしょうか？ ． Internal Controlが減少していることを示すためには、当然「18SやHPRT等よりも変動しない内部標準」で標準化する必要がありますよね？。 そういうものになにを用いたのかをお伺いしているわけです。

(無題) 削除/引用 No.777-5 - 2008/03/05 (水) 10:28:15 - MAC Internal Controlsよりも信頼のおける内部標準とは何でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.777-4 - 2008/03/05 (水) 07:49:16 - ぽすどくぅ そもそも何をもってInternal Controlが減少していると判断したのか気になります。 いわゆるInternal Controlsよりも信頼のおける内部標準としてなにを用いられたのでしょうか？ 「同じようにmRNA抽出してcDNA合成したのにThresholdが1サイクル分ずれたと」なんていうことではないわけですよね？

(無題) 削除/引用 No.777-3 - 2008/03/05 (水) 07:27:08 - おお コンフルの状態からと言う事なので、コンタクトインヒビッションもかかり細胞の代謝、生理的状態が変わってもおかしくはないと思いますが18sはそんなにぶれますでしょうか? 18sがぶれないならそれでやればいいと思いますが、、、、 0.1%のエタノールは許容範囲の最大値で、この濃度はよく使われると思いますのでほとんど問題ないとは思いますが、必要なら何も加えないもと比較すればいいのではないでしょうか。 どうも納得が行かなければ、同じ系でマイクロアレーをやっているデーターから探ってみればいいかもしれません。マイクロアレーは初めはハウスキーピングを使ってましたが、たいていグローバル(全シグナル)を参照してますので、ハウスキーピングでも幾らか変動が見れるはずです。

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