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なんか上手く行きそうです 削除/引用 No.773-12 - 2008/05/15 (木) 09:39:08 - ねぎ 皆様、だいぶ時間がたってしまいましたが、いつも御世話になっております。 様々な御助言を取り入れて実験を進めていますが、結構な数のクローンが取れてきました。 基本的にはclontechのプロトコールに従っていますが、形質転換時に試薬混合の順番をGietzらが推奨するプロトコールに記載されている順番に変えただけでコロニー数が跳ね上がりました！ おかげさまで、現在陽性クローンのphenotypeの最終確認段階ですが、MEL1活性が高いクローンがいくつか取れてきています。 同時にシーケンスの準備もしていますが、早く結果が見たいところです。 意外に簡単な解決（？）策でしたが、こうなるとメーカーのプロトコールも参考程度にとどめるべきなのかもしれませんね。 これからが大変なところですが、ここまで辿りつけたのも皆様の御助言があってのことです。感謝したします。

(無題) 削除/引用 No.773-11 - 2008/03/04 (火) 15:48:31 - ねぎ おおさん ＞１次スクリーニングと考えて、取れるだけ取る 全くその考え方でやっています。今回のbaitは細胞内interactorが全く分かっておらず、何かシグナル伝達系の分子が釣れてこないかという予想で開始しています。いろんな情報を総合すると、やはり1週間くらいは培養したほうが良さそうですね。

(無題) 削除/引用 No.773-10 - 2008/03/04 (火) 15:20:01 - おお 3日ぐらいでタイトに結合するものは、酵母のグロースに影響ない場合は生えてくると思います。私の場合は1週間ぐらいみました。これはセレクションの条件にもよるかもしれません。１次スクリーニングと考えて、取れるだけ取るというのも考え方かなと思いましたので。実際にグロースが通常のバイチでも可也遅いクローンも取れてきて、でもしっかりとポジティブだったものがありました。

(無題) 削除/引用 No.773-9 - 2008/03/04 (火) 13:57:32 - ねぎ 弘法さんレスありがとうございます。 前回は5日まで培養してデカい14コロニーを得ました。最低3日くらいと覚えておきます。 baitベクターのチェックでは-His培地でバックグラウンドはありませんでした。 3-ATも必要なさそうだったので結構無害なbaitだったようです。 これから再びTFにチャレンジしてきます。 このトピックは結果がでるまで開けておきますので、何か良い紹鴎がありましたら書き込んでいただけると嬉しいです。 おおさん、Tさんも引き続きよろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.773-8 - 2008/03/04 (火) 13:40:02 - 弘法 -Hisや-His Adeのスクリーニング培地で、強いpositiveなら３日でもちゃんとしたコロニーが出ますが、スクリーニングの際には１週間くらいまでは待ちました。小さいのがあんまり沢山出るようでしたら、早めに切り上げた方が良いと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.773-7 - 2008/03/04 (火) 12:59:39 - ねぎ 弘法さん、御助言ありがとうございます。 ＞この場合のポジコンというのはどういうものでしょうか 仰せのとおり、p53とLarge T antigenです。現在のところ、最もコロニーが出た時で10個程です（泣。予定では10E4くらいのはずでしたが・・・。 しかし、リニア分子のco-transformation効率がそれほど良いものとは知りませんでした。 ＞取れている14クローンのプラスミドを回収して再現性を確認してみては そうですね。寝かせているのもなんですし、再現性の確認してみます。 ついでに質問ですが、スクリーニング培地に酵母を播種した場合、どれくらいで生えてくるものなのでしょうか。酵母実験で一般的な知識が無いもので、教えていただけるとありがたいです。

(無題) 削除/引用 No.773-6 - 2008/03/04 (火) 11:46:24 - 弘法 それから、形質転換はシーケンシャルにされる方が効率もはるかに良いし、結果も安定します。

(無題) 削除/引用 No.773-5 - 2008/03/04 (火) 11:42:27 - 弘法 そのキットは使ったことがないのであまり自信がないのですが、1.1×を使う理由は細胞の容積を勘案してfinal 1×に近づけようとしているのではないでしょうか。 また、リニアな分子同士をco-transformationするという実験ですが、条件にもよるのでしょうがμg DNAあたりの形質転換効率は、不思議なことに下手をすると環状プラスミドより良いこともあります。プラスミドのhelicityが効いてるのかもしれません。 また、この場合のポジコンというのはどういうものでしょうか。p53とlarge Tをco-transformationされているのですか。そちらの形質転換に不都合があったかもしれませんので、取れている14クローンのプラスミドを回収して再現性を確認してみてはいかがですか。

(無題) 削除/引用 No.773-4 - 2008/03/04 (火) 11:27:06 - ねぎ おおさん、Tさん、早速のご返答ありがとうございました。 あまりに早かったのでびっくりしました（笑。 ＞おおさん 現在使用中のキットは、Matchmaker Library Construction & Screening Kitです。クロンテックで売っているライブラリは高いので、自前で作れるこのキットを導入しました。ご存じと思いますが、このキットは酵母内でライブラリcDNAとADベクターを再構成し、baitとの相互作用を見るものです。マニュアルではbaitベクターとライブラリと直鎖ADベクターを一気に放り込むという強引なTFですので効率は低くなるらしいです。実は1回スクリーニングしておりまして、このときは-His/-Leu/-Trpで14クローンがとれています。ただし、ポジコンがゼロでしたので信用できないというのが本音で、解析は進めていません。ポジコンが出るようになったらシーケンシャルなTFでやってみようと思っています。それとmaitingも考えたほうがよさそうですね。 ＞Tさん このページは僕も見ています。しかしせっかく高ぇキット買ったのだから・・・ということでまだキットを使っていますが、このページの方法も検討してみます。系が動かなければ先に進めませんからね。 それと、クロンテックのマニュアルでは1.1ｘTE/LiAcを使えと書いてありますが、なんか意味があるのでしょうか？ 僕なりにこのシステムは理解しているつもりですが、これがわからないんですよね。

(無題) 削除/引用 No.773-3 - 2008/03/04 (火) 10:25:29 - Ｔ 私はこのページのプロトコールを使っています。再現性よく高い効率が出ます。 www.umanitoba.ca/faculties/medicine/biochem/gietz/Trafo.html 同じグループが Nature Protocols にも数本記事を出しているので、そちらを参照してもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.773-2 - 2008/03/04 (火) 10:23:45 - おお >Baitベクターでの形質転換はそこそこの効率でできています これはYPD(A)を使って増やしてますよね。ですから、SD+必要なアミノ酸で増やして、短時間でもYPD(A)にスイッチしてからトランスフォーメーションしてみてはと思いました。全体で見ると意外とプラスミド落ちてないという経験がありますし、、でもライブラリーはちょっと怖いかもしれませんね。 そういう場合は、Y187にライブラリーをほりこんで、AH109とmatingさせるといいかもしれません。 あとは、スケールを小さくして(1/5ー1/10とか)、何回かトランスフォーメーションすることで補うとかいうのもてかもしれません。 私はクロンテックの新しいプロトコールはあまり好きではなくひとつ昔のプロトコール(ひとつ昔のトランスフェクションキットの方法)でやってました。 念のためクロンテックにあなたの使っているキットのロットで苦情が出てないかとか聞いてみてもいいかもしれませんね。

Transformation効率について 削除/引用 No.773-1 - 2008/03/04 (火) 09:59:07 - ねぎ いつも参考にさせていただいております。 私は最近Y2Hを始めた者ですが、酵母の形質転換が上手くいきません。 Baitベクターは特に問題なく作成できて、さてスクリーニングという段階に来ているのですが、テストで行ったポジコンの形質転換がさっぱりです。Baitベクターでの形質転換はそこそこの効率でできています。 菌株はAH109です。うちで使っている菌株がおかしいのかなと思い、近くのラボから貰って比較していますが、こっちも生えてきません。こうなると培地の問題か形質転換の方法が問題ということになりますが、いじるfactorがもう水くらいのところまできています。 ちなみに形質転換はクロンテックのマニュアル通りのLi/Ac法で行っています。 マニュアルに記載されていないコツとかがあるのでしょうか。 解決策をご存知の方、ぜひご教授願いたいと思います。

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