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(無題) 削除/引用 No.768-5 - 2008/03/05 (水) 13:48:05 - 名無し ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.768-4 - 2008/03/04 (火) 11:33:43 - 弘法 100kDaより小さいタンパク質であれば、遠心して回収した細胞をSDSサンプルバッファーに懸濁し、すぐに煮沸してその上清を泳動すれば大丈夫だと思います。沈殿は細胞壁などの不溶性の残渣ですので、あまり気にしなくともよいでしょう。ただしサイズの大きなタンパク質や疎水性の高いタンパク質などは、これでは失われる可能性もありますので、そのような場合にはグラスビーズなどで細胞を破砕する必要があります。 それより気にすべき事はタンパク質の分解です。酵母の液胞内にはプロテアーゼなどの加水分解酵素がしこたま詰まっているので、SDSサンプルバッファーに懸濁した状態で長く置くと、漏れ出たプロテアーゼが半端に変性して切れやすくなったタンパク質をズタズタにしてしまいます。懸濁から煮沸まで10秒程度を目標にしています。

(無題) 削除/引用 No.768-3 - 2008/03/04 (火) 02:22:23 - おお 細胞壁がありますので、酵母の場合それが不溶画分に来ます。SDSとかでは解けないでしょう。細胞壁はスカスカですが、ある程度壊した方がいいかと思います。クラスビーズ、凍結融解などを組み合わせるか、細胞へきを分解する酵素を使うか、フレンチプレスなどで壊すなどの作業をする事が多いです。ただし、細胞壁は分解しない限り不溶なので、フレンチプレス、グラスビーズをつかっても、同様の不溶性のものが残ると思います。

(無題) 削除/引用 No.768-2 - 2008/03/03 (月) 18:54:38 - Ｔ 初めて扱う材料なら、最低でもマニュアル本くらいは読んだ方がいいですよ。 動物細胞と違って酵母には堅い細胞壁というものがあるので、蛋白や核酸を抽出するときはこれをどうするかが問題になります。 蛋白を抽出する場合、私は下記の論文の方法を使っています。 "Rapid and reliable protein extraction from yeast" Yeast 16; 857-860 (2000) 専門家ではないので色々な方法を比較検討したわけではないですが、とりあえずうまく行っています。

酵母に詳しい人お願いします。 削除/引用 No.768-1 - 2008/03/03 (月) 17:58:31 - yeast ビギナー 今度、訳合ってしばらくの間酵母を実験材料に使う事になりました。主に酵母の蛋白質をWBとかで調べます。それでこの前whole cell extractから調べようと思いSDSサンプルバッファーで酵母を溶かそうとしました。でもこれがどうしても完全に溶けません。かなり長い事ほっといても溶けない固まりがけっこう残ります。バクテリアとか動物細胞の場合はSDS入れればほぼ完全に溶かせたので酵母も楽勝と思ったのですが酵母は全然感じが違いました。SDSでも可溶化しないということは、この溶けずに残ったものは蛋白質以外の成分なのでしょうか。それなら別にいいのですが、これが蛋白質だと困ります。また酵母そのものが十分に壊れていないとするともっと困ります。 それで、ふだん酵母を使っているひとはどうのようにwhole cell lysateを調製してSDS-PAGEとかしているのか教えて下さい。

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