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なるほど 削除/引用 No.767-10 - 2008/03/04 (火) 15:15:03 - WEST ＞回し者ではありません　さん そういった試薬もあるんですね。拝見したところ、かなり有用みたいですね。ただ、高価なので、もう少し検討したいと思います。 ＞ぽすどっく さん 私が調べた抗体は、一部の会社のものだけなので、配列に非依存性の抗リン酸化抗体もあるんですね・・・勉強不足でした。今後検討してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.767-9 - 2008/03/04 (火) 13:52:09 - ぽすどっく > ＞ぽすどっくさん > IPに関しては、後述のようにターゲットであるタンパク特異的のリン酸化抗体がないこと、phospho-tyrosineまたはphospho-serin/threoninの抗体は、自分が調べた限りではマッチする認識配列がないので、困難かと思っています。 完全に配列に依存しないかは定かではありませんが，多くの場合配列に非依存性の抗リン酸化抗体はいっぱいあります．P-Tyr-100，4G10，PY20，42H4とかいろいろ． そういうのは使えないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.767-8 - 2008/03/04 (火) 13:50:03 - 回し者ではありません ウエスタンできる抗体があるなら、Phos-tag Acrylamideをお勧めします。リン酸基にアフィニティのある試薬がアクリルアミドに結合したもので、SDS-PAGEに混ぜ込んで使います。リン酸化されているタンパク質の移動度が（通常のSDS-PAGEによる移動度とは違って）、間違いなく遅れます。 http://www.phos-tag.com/shouh/pt_page_e.pdf

ありがとうございます 削除/引用 No.767-6 - 2008/03/04 (火) 12:58:48 - WEST 皆様、丁寧なご回答ありがとうございます。 ＞コントロールさん 　実際にそのように論文でも報告されているみたいなので、この方法でやりたいと思います。 ＞ぽすどっくさん IPに関しては、後述のようにターゲットであるタンパク特異的のリン酸化抗体がないこと、phospho-tyrosineまたはphospho-serin/threoninの抗体は、自分が調べた限りではマッチする認識配列がないので、困難かと思っています。 ＞Ｋさん 　二次元での展開が確実かと思いますが、まずは一次元SDS-PAGEにてphosphataseやkinase inhibitorを作用させて確認したいと思います。 ＞おおさん 確かに、自分もphosphatase処理ではダメな場合はあると思います。ただ、皆さんの助言や論文から、シフトすればリン酸化していると言っても可能のようなので、まずはそれを試そうと思います。 リン酸化部位に関して、踏み込んでいく場合には、発現ベクターの使用やシークエンスを検討したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.767-5 - 2008/03/04 (火) 09:28:28 - おお 既知の燐酸化部位について、調べたいのであればその文献を引っ張ってきてその系を使うのがいいと思いますが、、、 フォスファターぜのシフトは直接的ですが2点ほど欠点があります。総べての燐酸化たんぱく質が燐酸化によりSDSPAGE上でシフトすると限りません。場合によっては2次元に展開しないと分からないかもしれません。 あと、あなたの考えているところが燐酸化されているかどうかも定かではありませんよね。最後にこれはそんなに懸念ではないですが、よく使われるCIAPやBAPで燐酸化が外れない可能性を完全に否定できません。 大雑把に燐酸化の可能せいを示すのであれば特異的抗体か、tagのついた発現ベクターで発現させIP後anti-phosphotyrosineまたはphosphoserin/phosphothreonin 抗体で検出するのが比較的簡単な方法ですが、anti-phosphoserin/phosphothreonin 抗体はあまりいい抗体がないという意見もチラホラ聞きます。この辺は使用経験がありませんので細かいコメントはできません。それと、IPですから同じサイズの違うタンパクがIPフラクションにあり、その燐酸化を見ていることを否定できません。 QIAGENから、燐酸化たんぱく質を吸着できるカラムが出てますので、これを使ってみる手はあるかもしれませんが、実際吸着力はそんなに劇的に強くないようなので万能かどうかは分かりません。 その部位が燐酸化しているかどうかについて決定的なものは、昔であれば32Pでラベルし、そのたんぱく質を回収し、ペプチドに分解して、燐酸化シグナルのあるペプチドの配列を読み(あるいはペプチドのアミノ酸組成から、シーケンスと会うところを探して)。さらにそのペプチドを完全にアミノ酸に分解して、セリン、スレオニンまたはチロシンに燐酸が入っているかを確認するといった作業です。 現在は、マススペックのほうが使い勝手がいいと思いますので、そちらのほうがやりやすいかと思います。 あとは、燐酸化ペプチドの合成が抗体精製レベルで可能になってから10年くらい立ちますかと思いますので、抗体を作るといったことも視野に入ってくるとは思います。 http://www1.qiagen.com/literature/handbooks/literature.aspx?id=1000173

(無題) 削除/引用 No.767-4 - 2008/03/04 (火) 06:53:38 - K Phosphatase処理にてバンドが下がる事での確認もありますが、２次元電気泳動にかけて スポットの変動を見るともっとクリアかと思います。 抗体はIPに耐えうるものがなかなかないようですね。 ウェスタンよりも難易度は高いかもしれませんが、電気泳動で得られたスポット／バンドを切り出し、IMACなどでリン酸化ペプチドを濃縮し、LC-MS/MSで測定するという方法もあります。

(無題) 削除/引用 No.767-3 - 2008/03/04 (火) 05:39:45 - ぽすどっく >また、リン酸化抗体でのIPも考えましたが、 こう考えたということは，タンパク特異的な抗体はあるということですよね． タンパク特異的抗体でIPして抗リン酸化抗体で検出はできないのですか？

(無題) 削除/引用 No.767-2 - 2008/03/04 (火) 04:31:19 - コントロール ＞その処理でリン酸化してると言えるのでしょうか? 言えます。 ＞また、western以外での確認方法があれば教えてください。 P３２ラベル、IPですね。

リン酸化 削除/引用 No.767-1 - 2008/03/03 (月) 02:48:04 - WEST はじめまして。 いつも参考にさせていただいてます。 今回は皆さんの助言を頂こうと思い、書き込みをしました。 現在、タンパクのリン酸化をwestern blottingにて 確認しようと予定していますが、 そのタンパク特異的なリン酸化抗体が見つかりません。 また、リン酸化抗体でのIPも考えましたが、 リン酸化部位にマッチしないので、困っています。 phosphatase処理にて、バンドが下がることで確認する方法もあると思いますが、その処理でリン酸化してると言えるのでしょうか? また、western以外での確認方法があれば教えてください。

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