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(無題) 削除/引用 No.763-10 - 2008/03/05 (水) 12:19:49 - おお >[Re:8] おおさんは書きました : > もうひとつ思いつきました。もしかしたら、燐酸化のあとの脱燐酸化の反応が比較的早いかもしれません。細胞に刺激を加える際に、フォスファターぜ存在下でやって見るとかと言うのもてかと思います。 もうお気づきですね。 フォスファターぜ存在下でなく フォスファターぜインヒビター存在下ですね。紛らわしい間違いをしてしまいました。 訂正しておきます。

(無題) 削除/引用 No.763-9 - 2008/03/04 (火) 18:23:19 - misawa おおさん 度重なるご助言，深謝いたします。 mediumにphosphatase inhibitorを入れてみることも是非トライしてみたいと思います。 他の因子というのは，PKCの下流の因子でしてそれらに関する論文報告からP-Yを予想したわけです。 過剰発現ですか。とりあえず，positiveかnegativeかもわからない状態なのでやってみようと思います。 NP-40の濃度ももう少し検討してみようと思います。 自分では思いもつかない点を指摘していただき，ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.763-8 - 2008/03/04 (火) 02:04:29 - おお もうひとつ思いつきました。もしかしたら、燐酸化のあとの脱燐酸化の反応が比較的早いかもしれません。細胞に刺激を加える際に、フォスファターぜ存在下でやって見るとかと言うのもてかと思います。

(無題) 削除/引用 No.763-7 - 2008/03/04 (火) 01:36:03 - おお >アポトーシス刺激による他の因子の活性化状態を考えると PKCdeltaの上流の情報が分かっているということでしょうか?もし、何が燐酸化するのか検討がついているのなら、そのタンパクでIPしてPKCdeltaの検出、PKCdeltaの燐酸化の検出をする手はないでしょうか? 批判的な意見もあると思いますが過剰発現で検出感度を上げる手もあるかと思います。 あと、１度どれくらいの効率でPKCdeltaがIPされているか簡単に調べてみてください、IPされているけど、つかないPKCdeltaがかなりあるようであれば、もっとマイルドなコンディションにしないといけないかもしれませんね。というのは2% NP-40はちょっと多いかと、、、(もちろん抗体やターゲットによりますからなんともいえませんが) いちどライセートを取ってしまえば、その後の操作のバッファーのNP-40を下げてもそんなに問題はないとも思いますし、、、

ありがとうございます 削除/引用 No.763-6 - 2008/03/02 (日) 19:46:37 - misawa りょうさん，おおさん，aさん ご助言ありがとうございます。 あるアポトーシス刺激を与えたときにPKCdeltaの阻害剤(rottlerin)を添加するとアポトーシス誘導が完全に阻害されることが分かりました。 ですので，このアポトーシスがPKC deltaを経由していることが分かりました。 しかし，皆様ご指摘の通り，チロシンのリン酸化が起きている保証はどこにもありません。 ただ，アポトーシス刺激による他の因子の活性化状態を考えるとチロシンのリン酸化が最も可能性が高いと考えた次第です。特異的抗体を用いる方法も考えましたが，リン酸化部位が種々有り特定できず，他の多くの論文がIPによる方法で行っていました。 4G10でIPして、PKCdeltaをウエスタンで検出すること，ポジコンとなるものを用意すること，phosphatase inhibitorを再検討することを行ってみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.763-5 - 2008/03/02 (日) 16:53:23 - a ひとつ思ったことは、PKCdeltaのリン酸化に対するphosphatase inhibitorは Na3VO4のみで大丈夫なのでしょうか？ 確実でないとしたら、多種類のinhibitorを入れてみてはどうでしょうか。 anti PKCdelta抗体でIPしてanti phospho-PKCdelta抗体でWBしておられる方がおられましたので参考にされてみては。 ( Neuroreport, Volume 14(3), 3 March 2003, pp 431-436)

(無題) 削除/引用 No.763-4 - 2008/03/02 (日) 10:49:36 - おお PKCについては詳しくはないですし、答えるのは難しいですがトータルのライセートをウエスタンしてマルチプルにバンドが出るようでしたら、おそらく、抗体は働いているだろうなとおもえます。それでも不安であれば、細胞をシーラムスタベーションの状態し、グロース用のメディウムに変えて30分(ホントはもっと短くてもいいかも)にサンプルをとり、スターべーションと比べてバンドの数、強さが増えているようであれば、そのレベルでは検出できているのは分かると思います。 ひとつ分からないのは、あなたの実験系でほんとにPKCdeltaのYが燐酸化されているでしょうか?もし、燐酸化について、すでに発表された物があるのでしたら、それと全く同じかできるだけ同じ系を用いてポジティブコントロールにするべきと思いますが、実際のところどうでしょうか? 生化学的な可能性としては、PKCdeltaの抗体が何らかの理由で、燐酸化されたPKCdeltaにアクセスしにくく、IPフラクションに来ないこともあり得ると思います。例えば4G10でIPして、PKCdeltaをウエスタンで検出できますか? 乱暴な方法としては、PKCdeltaIPフラクションにATPなどを添加し燐酸化反応をして4G10でウエスタンするとYの燐酸化の可能性は示せますが、あなたの実験の目的に合うかどうかは分かりかねます。 ちょっと観点をかえて、2DでPKCdeltaと4g10のウエスタンをし、燐酸化スポットを割り出すというのもありかと思います。１度スポットを割り出せば毎回両方のウエスタンをする必要はないかと思いますし。 参考になるかどうか分かりませんがWEBじょうで幾らかの情報が得られましたので、張っておきます。 http://www.exactantigen.com/review/phosphotyrosine.html http://www.millipore.com/catalogue/item/05-321

(無題) 削除/引用 No.763-3 - 2008/03/01 (土) 19:26:42 - りょう すみません、Na3VO4入れてられましたね・・・・失礼しました

(無題) 削除/引用 No.763-2 - 2008/03/01 (土) 19:25:38 - りょう phosphatase inhibitorをバッファーに入れておくべきでしょう。 検出に用いられているanti-pYは本当にworkする抗体なのか？ポジコンありますか？ あと、p-PKC-deltaのリン酸化には刺激は必要ないのか？刺激は入っているのか？ リン酸化抗体で検出する場合はスキムミルクでブロッキングすると駄目です。BSAとかに変えましょう。 気になるところはそんな感じです。

IPによるP-tyrosine 検出 削除/引用 No.763-1 - 2008/03/01 (土) 15:31:51 - misawa PKCdeltaをIPで落としてチロシンリン酸化をWBで検出することを試みております。 PKCdeltaのIPがうまくいっていることはWBで確認しているのですが，チロシンのリン酸化が検出できません。チロシンリン酸化の検出で特に注意すべき点，protocolの不適切な点などありましたらご教示下さい。 lysis-Bf: 0.1MTris(7.4), 0.3M NaCl, 20mMEDTA, 1mM Na3VO4, 2% NP-40, protease inhibitor 細胞をPBSでwash後，lysisBf500ulを入れ，on iceで30min， 14500rpm flash後，上清をとり，preclean。 （beads: agarose-G protein (santa cruz),15uL, 4度 1hr） 14500rpm flash後，上清をとり，PKCdeltaでIP。 　(PKCdelta: santa cruz(2ug, 4度, 1hr)) 　(beads: agarose-G protein (santa cruz),15uL, 4度 1hr） IP後，lysisBfで4回wash後，NP40とprotease inhibitorを抜いたlysis Bfでwash SDS含有Bfで100度，10minボイル。 SDSPAGEは1レーン10ulずつアプライ。 WB: P-Y抗体（upstate: 4G10) 宜しくお願いいたします。

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