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(無題) 削除/引用 No.760-9 - 2008/03/03 (月) 21:51:29 - 初心者 ＞~　さん 　参考にしてトライしてみたいと思います。 　ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.760-8 - 2008/03/03 (月) 09:16:06 - ~ パラフィルムで蓋を巻いて、 キムタオルで包んで、 ビニール袋に入れて、 エマルジョン状態を維持しながら20~30分振っていたと記憶しています。

(無題) 削除/引用 No.760-7 - 2008/03/02 (日) 16:15:38 - 初心者 ＞最近あんまりやらないなあ さん 　先日作ったpH7.5前後のもので、とりあえず試しに 　フェノール抽出してみようと思います。 　保存は、-20℃での保存を考えておりましたので 　問題なさそうですね。 　ご意見ありがとうございました。 ＞~　さん 　もしよろしければ、どのくらいの時間と強さで 　攪拌していたか教えていただけないでしょうか？ 　ヘキサキノリン、無くても保存法をしっかりしておけば 　大きな問題にはならないのですね。 　そうした実体験を聞けて、非常に参考になりました。 　ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.760-6 - 2008/03/02 (日) 15:33:24 - ~ 私が昔いたところでは、 1回目、1Mトリス(ph9.0)、 2回目以降は1Mトリス(pH8.0) でビンごと振っていました。 2~3回で平衡化できていました。 50mLチューブに分注して冷凍しておけば、キノリンがなくても問題は起きませんでしたが、 冷蔵保存していた人は、2ヶ月くらいで茶色に変色していました。

(無題) 削除/引用 No.760-5 - 2008/03/02 (日) 15:05:57 - 最近あんまりやらないなあ 0.5 Mまたは1 M Tris (pH 8.0)を等ボリュームほど加えて攪拌（いったん乳化する程度でよいはず）、放置、上清を取り除くことを3回ほど繰り返してやっています。本によっては、一回目をpHしないTris溶液でやるという方法も載っています。 ＞7,4-7.6以降pHが上がらず、行き詰っています。 pH 7.5前後なら実用上問題ないと思います。 なお、固形フェノールは水和すると融点が下がるので、あらかじめバッファーを加えてから温めたほうが早く液化します。ビン一本分に入るだけバッファーを加え、とけたら二本に分けてバッファー飽和の処理をしています。バッファー飽和フェノールは酸化する前に使い切らなければなりませんが、最近はフェノール抽出の出番が減っているので、50 mL コニカルに分注して-20℃で保存しています。

ありがとうございます！ 削除/引用 No.760-4 - 2008/03/01 (土) 23:52:32 - 初心者 返信ありがとうございます。 お二方のおっしゃるとおり、攪拌が不足しているようですね。 私が参考にしたプロトコルでは、 「融解したフェノールと0.5M Trisを10-15分ばかり激しく混合し、 　分離した上清を除去し、再度Trisを加え、再度攪拌する。 　その後遠心し、0.1M Trisで攪拌し、pHを測定する。 　攪拌が充分であれば、この時点でpHは7.8ぐらいになっている」 と書いてありました。 もう少し時間をかけてやる必要があるのですね。 スターラー、もしくは振盪器を使って長時間やってみようと思います。 ＞transplantさん 　本来は既に飽和しているフェノールを使ったほうが 　良いですよね。ただ、フェノクロやりはじめようしたこの時期、 　物品の注文が四月までできない状態なので、手元にある 　結晶フェノールでtryしようと思ったところなのです。 ＞ひまわりさん 　私が思ってる以上にしつこくしつこくやる必要があるのでしょうね。 　私は10分の攪拌と分離・上層の除去を６回ほどやりましたが、 　延べ時間で考えると、全然足りていないようですね。

(無題) 削除/引用 No.760-3 - 2008/03/01 (土) 13:51:30 - ひまわり 私は学生の頃、500gの結晶フェノールをビンごと湯浴で暖めて、溶けたらフラスコに移して2MのTris buffer pH 8.0をがっつり加えてスターラーでかき混ぜて平衡化していました。3〜5回くらいbufferを交換し5時間くらい時間をかけて作っていた記憶があります。参考までに。

(無題) 削除/引用 No.760-2 - 2008/03/01 (土) 01:32:45 - transplant 学生時代に一度だけ作った記憶がありますが… 確か、２０−３０分振る→ｐｈチェックを３回はやったような… （次の日に筋肉痛になるくらい）とことん混ぜないと飽和しないので、みんな必死でシャカシャカ振ってた覚えがあります。ですから、攪拌不足なのかもしれません。 ついでに一言申しますと、消費量・予算などいろいろあるとは思いますが、飽和フェノールは買ったほうが楽です。 作るのに手間がかかる上、手作業だと一度に作れる量も少ないですし。（一人だと５０ｍｌチューブ３本が限界じゃないですか？）

フェノールの飽和とpH調整 削除/引用 No.760-1 - 2008/03/01 (土) 00:43:31 - 初心者 はじめまして。 現在核酸抽出用の結晶フェノールをDNAのフェノール抽出に 使うために、0.5M Tris-HCl(pH8.0)を使って平衡化、 及びpH調整を行っています。 参考書を読んで、55℃にて融解したフェノール20mLと、 1/4量の0.5M Trisを50mLのチューブに入れて 10分ほど手で激しく混和した後、2000rpm/5分の遠心の後に 上清を除去しpHの確認を行ってみました。 しかし、思ったようにpHが7.8-8.0にならず、 繰り返し混和-遠心-ｐH確認を繰り返していますが、 7,4-7.6以降pHが上がらず、行き詰っています。 何か問題があるのでしょうか？ ちなみに、手元に8-ヘキサキノリンがないため 添加せずに上記の操作を行っております。

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