prostaglandin E2 express EIA kit（販売元：フナコシ）を用いてウサギ涙液中PGE2を測定したいと考えています。
本サンプル測定の前に、PGE2標準溶液を用いて希釈バリデーションを行っていますが、上手くいきません。
方法は、PGE2標準溶液1000pg/mL 40μLと付属のEIA buffer 80μLを混合して3倍希釈試料とし、同じチューブからのn=2でapplyしています。
実験の結果、well(1)でOD=0.521、測定値=93.255、算出濃度=280.7、相対誤差(RE)=-71% well(2)でOD=0.385、測定値=316.83、算出濃度=950.5、相対誤差(RE)=-4.95となり、well間で大きな誤差が出ました。同じ実験を何回か行いましたが、再現性がよくありません。
手技で気を付けていることは、
試薬、サンプル、プレートは15分以上室温に放置し、常温に戻す。
室温は20℃に設定、抗原抗体反応および発色は23℃の恒温器で実施。
試料をwellにapplyする際は、wellの底に触れないよう真ん中に滴下する。
プレートの洗浄時は、4回目まで洗浄液をデカントで捨て、5回目はデカントで捨てた後、キムタオルにプレートを叩きつけて水気をきる。
です。
一つ気になるのは、抗原抗体反応および発色の際は「ゆっくり円形に回転するもの」でプレートを揺さぶるのが良いのですが、そのような器械がないのでウェスタンブロット用のシーソーの動きの機械でプレートを揺すっていますが、それが原因でしょうか？
長文で申し訳ございませんが、ご教授お願い致します。 |
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