全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.752-7 - 2008/03/04 (火) 13:30:47 - 免染者 ＞blさん なるほど。抗体や観察条件を変えれば自家蛍光を減らしたり、時下蛍光かどうかを見分ける事が出来るのですね。 今回は１次抗体なし、２次抗体なしの切片も用意して観察し、自家蛍光が出ない事を確認しましたので、おそらく自家蛍光の問題は排除できるのではと考えています。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.752-6 - 2008/03/03 (月) 19:25:28 - bl 他に、自家蛍光を避けるためにはAlexa633や647等の近赤外の蛍光標識を用いるのが一番簡単で確実です。2色でやる場合には、もう一つはAlexa488にして、emission filterをロングパスではなく、500-530nmくらいのバンドパスフィルターで観察し、さらに488励起の場合のコントロールとして、560nmよりも長い波長を含むロングパスのフィルターで撮れる画像を用いると（大抵の自家蛍光は488nmで励起されて赤い蛍光も出すので）、シグナルと自家蛍光を見誤る事が減ります。

(無題) 削除/引用 No.752-5 - 2008/03/03 (月) 16:38:50 - 免染者 ＞APさん やはり２次抗体がクロスしてしまう事が問題みたいですね。 二次抗体を前吸収する方法があるのですか。 使っているのはマウスの脾臓なので、アセトンパウダーで吸収させて行ってみようかと思います。 ありがとうございました。 ＞組織さん ２次抗体を希釈していくだけでもある程度バックを下げられるんですね。 意外とやってませんでした。 そちらで美味く行くなら非常に簡単なので、まずはその方法で確認してみたいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.752-4 - 2008/02/28 (木) 16:38:49 - 組織 抗体の非特異吸着の部分は、一次抗体由来のバックの話でした。 問題は二次抗体由来のバックですね、無視してください。 それと、もしシグナルがある程度強く出ているのなら、二次抗体を希釈すれば少しコントラストが良くなると思います。

(無題) 削除/引用 No.752-3 - 2008/02/28 (木) 16:29:44 - 組織 バックはどんな感じに出ていますか？ 組織全体が光っているなら、抗体の非特異吸着が考えられます。 特定の細胞（特に細胞膜に）出ているのなら、Fcレセプターの影響が考えられます。 あとは、赤血球の自家蛍光も考えられます。 非特異吸着はTriton/PBSなどで浸透化処理をしたり、一次抗体をブロッキング液で希釈してやると、抑えられます。凍結切片では結構効果的です。 脾臓は造血系細胞が多いので、Fab抗体を使ってやると抗体とFcレセプターとの結合を防げます。 赤血球については、脾臓は含血量が多いので脱血した方が良いかもしれません。 一次抗体も二次抗体も無しのネガコンをおけば、組織由来の自家蛍光がどの程度あるかわかると思います。 APさんが言われている抗体の吸収処理も効果的だと思います。

(無題) 削除/引用 No.752-2 - 2008/02/28 (木) 15:14:21 - AP 材料はマウスかなんかでしょうか。 おそらく最大の問題は、二次抗体anti-rabbit/goat IgGが（脾臓に特に豊富に存在する）材料生物のIgに対しても交差反応することだと思います。交差反応を除くために異種のIgで吸収処理するなどしてある低交差性二次抗体を選んでいるでしょうか。 一つの対処法としては、材料生物の脾臓をアセトンパウダーにするなどして、二次抗体を前吸収してから使うといいと思います。

脾臓での免疫染色 削除/引用 No.752-1 - 2008/02/28 (木) 11:07:53 - 免染者 いつも参考にさせて頂いてます。 現在、脾臓の凍結切片を用いて免疫染色を行っているのですが、１次抗体なし／２次抗体ありのネガティブコントロールでバックが出てしまうため、サンプルが染まっているのかバックなのか判断が付かず困っています。 脾臓は4%PFAで4h、30%スクロースで一晩4℃でで置いた後、液体窒素で凍らせています。 抗体は、 １次抗体： rabbit anti-X、　goat anti-Y ２次抗体：donkey anti-rabbit IgG Alexa 594、donkey anti-goat IgG Alexa 488 １次抗体に関しては、他組織で抗体が使える事を確認しています。 ブロッキングは、10% BSA/PBS、10% goat serum/PBS、10% donkey serum/PBSのいずれかを用いてRTで１h行っています。 脾臓は血液系の細胞や成分が多いため免疫染色は難しいと聞いた事がありますが、何か脾臓での免染のコツ等ありましたら、ご教授の程よろしくお願いします。

全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---