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シークエンスに関しては 削除/引用 No.751-5 - 2008/02/29 (金) 13:36:35 - そば シークエンサー絡みのトラブルとして、polyAのような連続した同一塩基配列に続く配列が正常に読めなくなるというトラブルがあり、連続塩基後の一つ一つのピークがbroadになるという現象が観察されます。 連続塩基より先に読まれた配列は正常に解析されますが、連続塩基後の配列はピークがbroadになっているにも関わらず正常の場合と同じbase spacingで読まれるため、一つの塩基に対し多数の塩基を割り当ててしまうという結果を生じます。 例えば、AGCTという塩基に対しAAAAAAGGGGGGCCCCCCTTTTTTTTと判別してしまう、ということが起きます。 DNA　contaminationさんの仰っている事は、この現象を見ている可能性があると思うのですがどうでしょうか？ （polyA側からしか読んでない、raw dataを確認していない、などが思い当たるのであれば可能性はあるかな、と）

(無題) 削除/引用 No.751-4 - 2008/02/29 (金) 12:58:38 - ~ そのライブラリーを使ったことが無いのですが、トランジェントに発現させてlysisして、Luc活性が高いウェルのlysateからDNAを回収しているのでしょうか？ Cellからどのように回収しているのかが分からないのですが、 そこで変な配列を増やしているいうことはありませんか？ PCRで回収した際に、短いA~~Tの配列ばかり増幅されたとか。 トランスフェクション後はどのように扱っているのでしょうか？ 細胞の時点で、複数のシングルクローンで同じA~~Tの配列が取れるのであれば、 ライブラリーの質か、回収方法に問題があると思います。 １．独立して複数回のトランスフェクションをし、違う結果が得られるか ２．もとのライブラリーを大腸菌に入れた場合は、A~~Tがほとんど無い状態なのか 辺りをチェックしてみてはいかがでしょうか。 Lucということは、細胞を殺してアッセイしているのでしょうか？ GFPなどを使えば、FACSを使って生きた細胞で当たりを濃縮できると思います。

(無題) 削除/引用 No.751-3 - 2008/02/29 (金) 12:18:08 - とおりすがり 挿入部位をはさむプライマーでコロニーPCRとかはどうでしょう？

(無題) 削除/引用 No.751-2 - 2008/02/29 (金) 08:59:14 - おお AAAAAAGGGGGGCCCCCCCTTTTTTT なにかoligodTの後ろにリンカーつけたものが何かのアクシデント(セルフでアニーリングしたり)でインサートされてしまった様な感じがしないでもないです。 もしそのカスのインサートがお示しになった配列以外に何もないか、非常に短い場合、”当たり”を含むDNAをシングルクローンにせず、制限酵素でインサートを切出し、ハズレのクローンのインサートより長いフラクションを得(例えば300bps以上とか)、クローニングベクターに掘り込んでクローンしてみてばどうでしょうか?長さのによるフラクションは電気えいどうの切出しでもできますし、クロンテックなどのクロマスピン(だったかな)を使えばできます。 また、そのハズレのベクターが実際に貴方の実験系で影響しないのであれば2次のスクリーニングというのも手ですが、この辺は慎重にやらないと、ハズレばかりを増幅してしまうはめになります。 アトクロンテックが、ライブラリースクリーニングに、一部シーケンスが分かっている場合それをライブラリーからプルダウンするシステムを売っていたと思います。逆にネガティブのそのシーケンスでプルダウンして、スルーしたものをというのもいけるかもしれません。でもこれはちょっと冒険ですし、まず、その配列がちゃんとしたクローンに入っていないことが前提になります。 シングルクローンを拾わず、ニトロセルロースとかに大腸菌コロニーをレプリカし、そのかすのシーケンスでハイブリして、ネガティブ(ハイブリでシグナルがない)だけをピックアップするというのもありかもしれません。これもちゃんとしたクローンがその配列を持たないことが前提です。

ｃDNAのコンタミネーションについて 削除/引用 No.751-1 - 2008/02/28 (木) 08:41:37 - DNA　contamination はじめまして。現在取り組んでいるシグナリング経路解明のためｃDNAスクリーニングを行っています。セットアップとしてはシグナリングの結果誘導されるｇｅｎｅのプロモーターＬｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現するstable　cell　lineにｃDNAtransfectionすることでスクリーニングを行っています。MGCクローンｃDNA　libraryを使いスクリーニングしましたところ、幸いいくつか本物らしき候補が見つかりました。しかしここからが地獄の始まりで、ご存知の方もいらっしゃるかと思うのですがこのｃDNAライブラリーの30%はコンタミネーションがあり、私の今回の当たりもそれに該当します。ただ”当たり”はそこにあるので、コンタミネーションを取り除ければと考えています。よってその”当たり”を含むDNAを再度大腸菌にtransformして、シングルコロニーを１５個を拾い、それをシークエンスしたところAAAAAGGGGGGGCCCCCCTTTTTTのようなシークエンスがpolyAの上流にすべてのクローンから認められました。もちろんこれらの15クローンを用いた再スクリーニングでは結果はすべてnegativeでした。似たようなご経験のある方で何か効率のよいDNAのセレクションの方法をご教授いただけるとありがたいです。それと上でふれましたAAAAAAGGGGGGCCCCCCCTTTTTTTのようなシークエンスはいったいどこから来るのでしょう？もちろんBlastでは何も引っかかりませんでした。

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