プー様
> ジャーナル等を参考にする限りでは目的遺伝子を入れていない空ベクターをコントロールとするのが普通ですね。
>
確かに普通に考えればその通りで、私も空ベクターでコントロールを取っていましたが、下の方々もおっしゃっていますようにMCSに何も入れないままでIRESは働くのだろうか？と疑問に思い質問したわけです。
mugimaki様
> IRES-AcGFP1を使用しています。
> 何も入れない「からvector」ではAcGFP1の発現が起きません。
> メーカーの説明では、MCSに何か適当なORFを入れないとIRESが働きにくく
> レポータータンパクの発現がないとのことでした。
やはりそうですか。全てのIRESベクターで同様の現象が起きると考える方がいいのでしょうか？
>
> DsRedでも同様の現象が起きると思われるので、何か適当なORFを
> 入れた方がいいのではと思います。取り敢えずからvectorをtransfection
> してみて発光があるかどうかを確認してみてはいかがでしょうか。
上述しました通り、それは行いました。
発光する細胞は僅かですがありましたが、実験群と比較すると少ないです。少しでも蛍光が観察されれば「導入されている」と判断してコントロールとすればいいのかとも考えましたが、ターゲット遺伝子発現量の差が導入効率の違いによるものではないか？との疑問には答えられないわけです。DsRedの遺伝子量を測定して差がないことを示せばいいのかもしれませんが。。。
やはり何らかのミュータントを作って入れた方がコントロールとして正確なのかも知れません。
とも様
> 過剰に発現させて何かを見る場合、一番良いのはその遺伝子の変異体。
> Aというタンパクの酵素活性を見る場合は酵素活性変異体などです。
基礎的な質問で申し訳ありませんが、変異体というのは部分的に塩基置換する、というのでは駄目なのでしょうか？新規タンパクなので構造解析データもなく変異体作製に関してイメージが湧きません。
ご教授いただければ助かります。 |
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